石菖蒲水提取物對(duì)人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NO 表達(dá)的影響

楊海淦 曹 蕊 王茂杰 陳育忠

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510000；3.廣東省中醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東廣州 510000

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞簡(jiǎn)稱膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的重要組成部分，約占90%[1]。自Pfrieger 等[2]1997 年首次報(bào)道膠質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)神經(jīng)元間的突觸聯(lián)系后，膠質(zhì)細(xì)胞的作用越來越引起神經(jīng)科學(xué)研究者的重視。

一氧化氮（NO）是一種非經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，參與膠質(zhì)細(xì)胞各種生理及病理狀態(tài)的調(diào)控，是細(xì)胞間信息交換的重要介質(zhì)。NO 根據(jù)所處氧化狀態(tài)的不同，可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性作用[3-7]。NO 在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，而在高濃度時(shí)則可產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[8]。

歷代本草中，普遍認(rèn)為石菖蒲性味辛、苦、溫，入心、胃經(jīng)，能豁痰開竅、化濕和胃、醒神益智，是芳香寧神、滌痰開竅之要藥。臨床上常用于熱病神昏、癲狂、痰厥、健忘、阿爾茨海默病等疾病的治療。研究[9]發(fā)現(xiàn)，石菖蒲具有良好的腦細(xì)胞保護(hù)作用，能增加小鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低腦內(nèi)過氧化脂質(zhì)（LPO）水平。然而，相關(guān)研究?jī)H僅局限于石菖蒲有效成分的藥理作用上，并未從免疫生化以及分子遺傳等方面進(jìn)行探討。為了進(jìn)一步從分子生化方面探討石菖蒲作用的相關(guān)機(jī)制，筆者設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

人腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（HEB，中山大學(xué)細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（Gibco 公司）；0.25% 供應(yīng)胰酶（Trypsin-EDTA）（1×）（GIBCO）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）PH 7.2 basic（1×）（GENOM）；石菖蒲飲片（康華藥業(yè)）；四甲基偶氮唑鹽比色試劑（MTT）（廣州妙博生物技術(shù)有限公司）；NO（碧云天生物技術(shù)）；倒置顯微鏡（NIKON TE300）；二氧化碳培養(yǎng)箱（HSO301T-VBA）；真空冷凍干燥機(jī)（Christ Alpha2-4LSC-Plus）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10basic V）。

1.2 石菖蒲凍干粉的制作

將100 g 石菖蒲飲片高速粉碎后轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加1000 mL 的超純水，于電熱套上加熱，猛火燒沸后調(diào)至溫火繼續(xù)煮1 h，收集第一遍的水提液；再加400 mL 超純水至藥渣中繼續(xù)第二次煎煮，時(shí)間火候同第1 次，后將2 次收集的水提液混合；將收集的水提液離心2 次（3000 r/min，5 min），收集上清液，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，最終濃縮液量約為100 mL，即藥物濃度為1 g/mL。

將濃縮液分裝于培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封好，置于-80℃冰箱過夜。隔日放于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h。干燥后將凍干粉轉(zhuǎn)移到離心管中，稱量后分裝保存。使用前先用細(xì)胞培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）配成濃度為1 mg/mL 的母液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HEB 置于37℃5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)將舊的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，加2 mL PBS洗2 次，去掉PBS，再加1 mL 胰酶進(jìn)行消化，時(shí)間大約1 min，迅速去掉胰酶，加入3 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，后進(jìn)行吹打，使細(xì)胞剝落，充分吹勻后平均分到2 個(gè)75 mm2的培養(yǎng)瓶中，再向培養(yǎng)瓶中加入5 mL完成培養(yǎng)基，擰好蓋子后放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活性

細(xì)胞以每孔3000 個(gè)細(xì)胞種于96 孔板種，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，分成對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液0 μg/L）、石菖蒲水提取物組，分別加入37.5、75、150、300、600、1000 μg/L 的石菖蒲水提取物。放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間（24、36、48 h）。每隔12 h 取1 個(gè)96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避光，每孔加20 μL MTT 試劑（5 mg/mL），放回培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育完成后用一次性無菌注射器（1 mL）貼壁慢慢吸走含MTT 的培養(yǎng)液，再每孔加入150 mL 的DMSO，于多微孔板震蕩器上震蕩10 min。在酶標(biāo)儀上使用570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值，保存數(shù)據(jù)。

1.5 檢測(cè)NO 的表達(dá)

以每孔10 萬個(gè)細(xì)胞數(shù)種24 孔板，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加用不同濃度的LPS（0、10、100、1000、10 000、20 000 ng/mL）放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。確定LPS 濃液后，進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)分成對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液組）、石菖蒲37.5 μg/mL 組、石菖蒲75 μg/mL 組、石菖蒲150 μg/mL 組、石菖蒲300 μg/mL組、石菖蒲600 μg/mL 組。培養(yǎng)2 h 后加用LPS（1 μg/mL），放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)22 h，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取出NO 試劑盒的Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使回復(fù)室溫。用DMEM+10%FBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1～100 μmol/L），使其梯度為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔，在96 孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及培養(yǎng)液上清。按50 μL/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent Ⅰ以及Griess Reagent Ⅱ，最后在酶標(biāo)儀上使用540 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值，保存記錄數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石菖蒲水提取物藥物濃度選擇

MTT 結(jié)果提示石菖蒲水提取物對(duì)HEB 細(xì)胞活性具有顯著抑制作用（P ＜0.05），且呈濃度和時(shí)間依賴性。而1000 μg/mL 濃度的石菖蒲水提取物出現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞活性，考慮與藥物濃度過大出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用。見表1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選0～600 μg/mL 的濃度范圍。

2.2 不同濃度LPS 對(duì)HEB 誘導(dǎo)的NO 表達(dá)的影響

在加用LPS 后可發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度≥100 ng/mL 時(shí)即可明顯誘發(fā)HEB 產(chǎn)生大量NO，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），而且隨著藥物濃度的不斷升高，其效應(yīng)更加明顯，提示LPS（100 ng/mL）可成功誘導(dǎo)HEB 的病理模型。見表2。

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

表1 不同濃度石菖蒲水提取物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性平均抑制率的比較（±s，n=3）

注：與對(duì)照組（0 μg/mL）比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，#P ＜0.001

表2 不同濃度LPS 對(duì)HEB 誘導(dǎo)NO 表達(dá)的影響

2.3 不同濃度石菖蒲水提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HEB NO 的表達(dá)的影響

在LPS 誘導(dǎo)的HEB 病理模型上，加用石菖蒲水提取物后可明顯抑制NO 的表達(dá)。在低濃度37.5 μg/mL即可明顯抑制由LPS 1 μg/mL 所誘導(dǎo)的NO 高表達(dá)。隨著藥物濃度升高，其抑制作用明顯增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表3。

表3 不同濃度石菖蒲水提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HEB NO 表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

既往對(duì)石菖蒲的藥理研究主要集中在揮發(fā)油、水煎液、水提醇沉液對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用上，普遍認(rèn)為石菖蒲揮發(fā)油具有中樞鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥作用[10-14]。如早在1982 年，金維岳[15]經(jīng)過相關(guān)臨床研究后提出，用單味石菖蒲揮發(fā)油制成的注射液（0.5%總揮發(fā)油溶液）治療肺性腦病昏迷，能迅速消除意識(shí)障礙和神經(jīng)精神癥狀，有效率高達(dá)74.97%。此外，石菖蒲能促進(jìn)正常小鼠學(xué)習(xí)記憶和記憶獲得[16]。21 世紀(jì)，方永奇等[17]研究石菖蒲醒腦開竅作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究，提出石菖蒲醒腦開竅和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的有效部位主要是揮發(fā)油和β-細(xì)辛醚。故無論是中國歷史文獻(xiàn)資料還或現(xiàn)代臨床及機(jī)制研究結(jié)果都表明石菖蒲對(duì)大腦的正常功能發(fā)揮起到促進(jìn)作用。然而，本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲水提取物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性并無明顯作用，考慮可能與其正性作用僅僅體現(xiàn)在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)即神經(jīng)元的影響上，而對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的功能并無明顯的促進(jìn)作用。

NO 是由L-精氨酸（LArg）和分子氧為底物，在一氧化氮合成酶（NOS）的催化和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黃素單核苷酸（FMN）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四氫生物喋呤（BH4）等因子輔助下，使L-精氨酸的胍基氮原子被氧化而成的[18]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的NOS 為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，在細(xì)胞因子、內(nèi)毒素以及某些內(nèi)源性異常蛋白的作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的NO，為病理型[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的HFB 中NO 的濃度，推測(cè)很有可能石菖蒲提取物是通過直接抑制誘導(dǎo)型NOS 的活性或影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸或分子氧兩種底物的濃度，或iNOS催化過程中所需要的各種輔助因子的合成過程有關(guān)。故而進(jìn)一步闡明石菖蒲提取物對(duì)病理型NO 的生成過程各種因子及催化酶的影響將成為我們今后努力的方向之一。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物對(duì)未誘導(dǎo)的正常HEB 并沒有抑制作用，而且MTT 結(jié)果也提示其對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，這可能與HEB 在被誘導(dǎo)活化后某基因的異常表達(dá)有關(guān)。