HIV/HBV合并感染者HBV核心區(qū)與多聚合酶區(qū)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位變異分析

鄧西子，聶 源，蘭 蕓，李 鋒，高 鳴，蔡衛(wèi)平，李凌華，胡鳳玉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)通過(guò)識(shí)別HBV抗原表位，在清除細(xì)胞內(nèi)感染病毒發(fā)揮關(guān)鍵作用。HBV的核心(core,C)區(qū)和多聚合酶(polymerase,P)區(qū)基因變異導(dǎo)致編碼的氨基酸突變，CTL抗原表位的序列或構(gòu)象發(fā)生改變進(jìn)而引起表位的免疫原性改變，導(dǎo)致宿主抗HBV的免疫應(yīng)答發(fā)生改變。若反應(yīng)強(qiáng)度不足，病毒難以清除，感染慢性化從而進(jìn)展為肝硬化、肝癌[1-2]。研究報(bào)道，合并人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染造成的免疫缺陷明顯加速HBV所致的肝病進(jìn)程，終末性肝病(包括肝硬化、肝癌、肝衰竭)已成為HIV感染者死亡的首要原因，具體機(jī)制不明[3-4]。目前，HIV/HBV合并感染是否影響HBV的C蛋白和P蛋白的特異性CTL表位變異進(jìn)而與肝病進(jìn)程加快關(guān)聯(lián)尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究擬以直接測(cè)序法，對(duì)HIV/HBV合并感染者C區(qū)和P區(qū)的CTL表位變異進(jìn)行檢測(cè)分析，并以HBV單一感染者為對(duì)照，研究HIV/HBV合并感染者C區(qū)和P區(qū)的CTL表位變異特征，為深入探討HIV/HBV合并感染者疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸的致病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年1月—2011年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第八人民醫(yī)院收治的慢性HBV感染者，依據(jù)治療前HIV抗體檢測(cè)結(jié)果分為HIV/HBV合并感染組和HBV單一感染組。所有患者均經(jīng)過(guò)乙肝血清標(biāo)志物檢測(cè)且表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽(yáng)性>6月確診HBV感染，所有HIV/HBV合并感染者均經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡法確診抗-HIV陽(yáng)性。獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)和慢性HBV感染的診斷見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5-6]。成功擴(kuò)增C區(qū)和P區(qū)的慢性HBV感染者共151例，其中HIV/HBV合并感染者83例，HBV單一感染68例。2組患者性別組成、年齡、基因型、HBeAg狀態(tài)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、HBV載量差異比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他肝炎病毒的感染和AIDS相關(guān)性的明顯的機(jī)會(huì)性感染；已進(jìn)行抗病毒治療；明顯的肝硬化、肝衰竭和肝癌等終末性肝?。荒挲g<18歲、孕婦、哺乳期者；HBV載量<500 U/mL。本研究所采用的樣本來(lái)自于患者臨床常規(guī)檢測(cè)剩余的血清樣本，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)并獲得受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV基因擴(kuò)增 采用QIAamp DNA mini Kit(250)試劑盒(美國(guó)羅氏公司)提取血清中的HBV DNA。HBV DNA擴(kuò)增：PCR第1輪反應(yīng)：正向引物5′-GTTCATGTCCWACTGTTCAAGCCTCCAAG-3′；反向引物5′-GTTGCATGGTGCTGGTGMRCAGACCAA-3′，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循環(huán)30次)；延伸72 ℃ 7 min。PCR第2輪反應(yīng)：正向引物5′-GGTCTTRCATAAGAGGACTCTTGGACT-3′；反向引物5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3′，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循環(huán)35次)；延伸72 ℃ 7 min。

1.2.2 DNA序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后送英濰捷基(Invitrogen)公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序方法為Sanger雙氧鏈末端終止法測(cè)序。測(cè)序引物：片段1：P1(正向)5′-CATCCTGCTGCTATGCCTCA-3′，P2(反向)5′-AGAGGTTCCTTGAGCAGG-3′，P3(正向)5′-CCTATTGATTGGAAAGTATGTC-3′，P4(正向)5′-GACGTCCTTTGTTTACGTCC-3′；片段2：P5(正向)5′-GGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3′，P6(反向)5′-AGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3′，P7(正向)5′-GTGGGTCACCATATTCTTGG-3′，P8(正向)5′-TTGGTGTCTTTTGGAGTGTG-3′。采用ContigExpress軟件進(jìn)行序列整理、拼接，采用Vector NTI軟件對(duì)基因序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)數(shù)含有表位變異的序列數(shù)。參考序列號(hào)：B1 D00329；B2 AF121249；B3 M54923；B4 AY033072；B5 AB219429；C1 AY057947；C2 AY217378；C3 X75665；C4 AB048705；C5 AB241111。HBV C區(qū)和P區(qū)抗原表位見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7-8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組患者表位變異率比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者CTL表位變異差異分析 HBV C區(qū)和P區(qū)含有10個(gè)抗原表位位點(diǎn)，HIV/HBV合并感染組較HBV單一感染組CTL表位變異發(fā)生率偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148表位變異發(fā)生率差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.509，P=0.006;χ2=3.902，P=0.048;χ2=4.238，P=0.040)?；蛐蛯?duì)2組患者表位變異發(fā)生率無(wú)明顯影響(數(shù)據(jù)未給出)。各CTL表位變異率和分析結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 2組患者CTL表位變異氨基酸分析 表位的氨基酸變異中，多數(shù)只有一個(gè)氨基酸替換為其余氨基酸，只有C139-148和P575-583表位出現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)氨基酸的替換。C18-27表位主要變異的氨基酸，HBV單一感染組有I27V(4.4%)，而在HIV/HBV合并感染組除I27V(6.0%)變異外，還有新的S26N(4.8%)、S26T(4.8%)變異類(lèi)型。C88-96、C139-148表位主要變異氨基酸(L95I、T147A)兩組患者相同，但顯示HIV/HBV合并感染組更高的比例。具體CTL表位氨基酸變異見(jiàn)表2。

表1 2組患者CTL表位變異發(fā)生率[n(%)]

注：與HBV單一感染組比較，*P<0.05

表2 2組患者CTL表位變異氨基酸

注：變異的氨基酸以下劃線表示。

3 討論

由于HIV和HBV有相似的傳播途徑(性接觸、血液傳播、垂直傳播)，HIV感染者常合并HBV感染，我國(guó)HIV/AIDS人群中合并HBV感染率為4.2%～19.4%[9]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法雖可同時(shí)抑制患者HIV和HBV復(fù)制，延長(zhǎng)HIV感染者的預(yù)期壽命，但都不能徹底清除HIV病毒庫(kù)和HBV cccDNA，HBV所致的終末性肝病已成為HIV/AIDS患者死亡的首要原因，但具體機(jī)制不明[3-4]。HBV特異性CTL應(yīng)答是決定宿主能否有效清除細(xì)胞內(nèi)HBV的關(guān)鍵因素，CTL細(xì)胞通過(guò)識(shí)別HBV抗原特異性表位清除病毒，如果表位中氨基酸發(fā)生變異，降低與CTL細(xì)胞受體的親和力，可使HBV逃避免疫監(jiān)視，加快肝病進(jìn)展[10]。HBV基因組的C區(qū)編碼的C蛋白和P區(qū)編碼P蛋白包含多個(gè)能被有效識(shí)別的抗原表位，我們的研究結(jié)果顯示，HIV/HBV合并感染組較HBV單一感染組C區(qū)和P區(qū)的CTL表位變異發(fā)生率整體偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位變異發(fā)生率差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究報(bào)道，在未經(jīng)治療的HIV感染者胃腸道CD4+T淋巴細(xì)胞的消耗導(dǎo)致微生物易位增加，引起循環(huán)中脂多糖水平升高，脂多糖可結(jié)合Toll樣受體4并激活核因子-κB等其他通路，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和免疫過(guò)度的慢性活化[11-12]。HIV/HBV合并感染及其造成的免疫改變?cè)贖BV分子進(jìn)化中扮演重要的調(diào)控作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)HIV/HBV合并感染組CTL表位變異率較高可能是病毒逃避宿主免疫壓力作用下選擇的結(jié)果。

HBV的全基因組編碼多種病毒蛋白，其中C蛋白的抗原性最強(qiáng)，保守性最好，C蛋白能引起較其他蛋白更強(qiáng)的CTL應(yīng)答。研究報(bào)道，HIV/HBV合并感染者有更高的1762T/1764A突變[14]，同樣也有報(bào)道在HIV/HBV合并感染者常見(jiàn)-1G缺失突變[15]，然而來(lái)自泰國(guó)的研究報(bào)道，2組C區(qū)基因變異無(wú)差異[16]，但是這些研究都是基于直接序列分析結(jié)果，涉及抗原表位變異的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)HIV/HBV合并感染組C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位變異率較HBV單一感染組顯著增加。CTL表位變異與病程的進(jìn)展有明顯的相關(guān)性，尤其是C18-27表位[17]，此結(jié)果可為深入研究合并感染致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。變異氨基酸結(jié)果顯示，HIV/HBV合并感染組的C18-27表位主要變異氨基酸的類(lèi)型增多，出現(xiàn)獨(dú)特性S26N(4.8%)、S26T(4.8%)變異，而C88-96、C139-148表位2組患者主要變異氨基酸類(lèi)型相同。P區(qū)表位變異比較中，2組之間無(wú)明顯差異，其中包括有致拉米夫定耐藥的YMDD位點(diǎn)的P551-559(YMDDVVLGA)表位。

綜上，本研究通過(guò)分析HIV/HBV合并感染組與HBV單一感染組HBV的C區(qū)和P區(qū)的CTL表位變異差異，發(fā)現(xiàn)HIV/HBV合并感染可增加HBV CTL表位變異，尤其是HBV C18-27、C88-96、C139-148表位變異，提示HIV/HBV合并感染者肝病進(jìn)程加快可能與HBV C區(qū)的CTL表位變異增加相關(guān)，具體影響機(jī)制有待深入研究。