多中心風(fēng)濕免疫病生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)與意義

曾惠瓊，丁慧華，熊力群，唐元家，孫華麟，康曉楠，張 躍，葉志中

生物樣本庫是一種集中保存各種人類生物材料，用于疾病的臨床治療和生命科學(xué)研究的生物應(yīng)用系統(tǒng)。基于收集高質(zhì)量的結(jié)締組織病組織及以血液、尿液為主的體液樣本是發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕免疫病遺傳生物標(biāo)志物及藥物作用新靶點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。生物樣本資源的重要性已經(jīng)得到充分的認(rèn)識和廣泛的重視[1-2]。2015年,美國宣布啟動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃；2016年,我國科技部將精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)納入到“十三五”重大科技專項(xiàng)。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展同樣需要生物樣本庫，作為專項(xiàng)指南明確指出，開展健康隊(duì)列、重大疾病、罕見病等研究，必須有生物樣本庫、數(shù)據(jù)庫等平臺作為課題研究支撐。為了整合深圳市人群病例資源，為臨床與基礎(chǔ)科學(xué)研究提供可靠的資源平臺，深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病?？漆t(yī)院自2014年12月開始組建深圳市人群風(fēng)濕免疫病生物樣本庫，并利用深圳市“三名工程”平臺柔性引進(jìn)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科并與之合作，實(shí)現(xiàn)多中心、云共享管理模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 所有病例均來源于在我院門診及住院風(fēng)濕病患者，原則上，所有風(fēng)濕免疫病均具備入庫資格，但基于我院實(shí)際情況，我們重點(diǎn)采集系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erethematosus,SLE)、骨性關(guān)節(jié)炎(Ostoarthritis,OA)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)、骨質(zhì)疏松癥、強(qiáng)直性脊柱炎、干燥綜合癥、系統(tǒng)性血管炎、未分化結(jié)締組織病8個(gè)病種。所有患者診斷均符合各個(gè)病種診斷及治療指南。所有入組患者均填寫詳細(xì)問卷，包括一般人口學(xué)、疾病、流行病學(xué)、家系等資料。

1.1.2 主要設(shè)備 4 ℃冰箱(579L，青島海爾集團(tuán))，-80 ℃冰箱(DW-86L-286，青島海爾集團(tuán))，臺式離心機(jī)(600C，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，Real-time PCR擴(kuò)增儀(ABI7300，美國Thermo Fisher公司)，紫外/可見光光度計(jì)(NanoDrop 2000，美國Thermo Fisher公司),電熱恒溫水箱(CU-420型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，貝迪打印機(jī)(BP-IP300，美國BRADY公司),液氮罐(YDS-65-216，成都金鳳液氮容器有限公司)、-20 ℃、-4 ℃冰箱(BCD-257SL，青島海爾集團(tuán))、凝膠電泳分析系統(tǒng)(GDS-8000,英國UVP公司)。另設(shè)PCR室、分子生物室、血清室等用于提取核酸，分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)行PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)相關(guān)研究。

1.2 方法

1.2.1 人員配置與建庫流程 參照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科生物樣本庫的建設(shè)模式[3]，參考生物樣本庫國際規(guī)范和指南標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)[4]。結(jié)合醫(yī)院自身特點(diǎn)，我院生物樣本庫組織架構(gòu)主要由以下部分組成:執(zhí)行委員會、學(xué)術(shù)委員會、倫理委員會、質(zhì)控小組等。在此基礎(chǔ)上安排科研助理專員、質(zhì)控專員分別負(fù)責(zé)樣本的采集和前處理、核酸蛋白提取和質(zhì)量管理、樣本信息數(shù)據(jù)管理、樣本出入庫和常務(wù)管理等，并按照崗位職責(zé)的不同給予相應(yīng)的培訓(xùn)內(nèi)容、方式、要求和頻率，定期參加生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)會議。

1.2.2 倫理規(guī)范 收集生物樣本庫樣本必須先征得患者的知情同意并簽署知情同意書。同時(shí)經(jīng)過我院倫理委員會審查，嚴(yán)格保護(hù)患者隱私和權(quán)益。

1.2.3 組織樣本的采集和處理

1.2.3.1 血液樣本的采集與保存 血清、血漿、全血(用于備提RNA，DNA和外周血單個(gè)核細(xì)胞等)。血液樣本采集選用風(fēng)濕病患者外周靜脈采血，采集方案選擇應(yīng)遵循不同項(xiàng)目方案，成人捐獻(xiàn)者采集量一般為10～15 mL，其中10 mL抗凝管，5 mL促凝管。血清樣本使用標(biāo)準(zhǔn)真空負(fù)壓采血管，常溫直立靜置30 min，待血液凝固析出血清，分管，標(biāo)記，入庫。全血采集至抗凝管充分顛倒混勻后，分裝分離血漿和白細(xì)胞，標(biāo)記，入庫。血漿留取后分管，標(biāo)記，入庫，剩下部分用于分離粒細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞等，提取后標(biāo)記，入庫。核對樣本標(biāo)簽編號后入庫-80 ℃冰箱或液氮罐保存。

1.2.3.2 尿液樣本的采集與保存 尿液采集相對簡單，尿液是蛋白質(zhì)、代謝物的主要來源之一。我們收集風(fēng)濕病患者晨尿或隨機(jī)尿液、24 h尿液。單次尿液采集量50 mL。根據(jù)研究目的和用途，可分為混勻尿、尿液上清和尿沉渣。采集后標(biāo)記，入庫，將凍存管裝盒后根據(jù)系統(tǒng)分配位置凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3.3 唾液樣本的采集與保存 目前采用唾液采集管(Salivette)采集唾液后離心獲得樣本，常溫保存，采集后的唾液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行直接分裝或低速離心，產(chǎn)生的上清和沉淀分別單獨(dú)保存。唾液樣本建議500 μL/管分裝。若需長期保存可進(jìn)行凍存(-80 ℃保存)。該樣本與尿液一樣屬于無創(chuàng)性操作，簡單易行，目前國內(nèi)罕見有生物樣本庫存儲此類樣本，開發(fā)用于唾液收集和基于SOPS標(biāo)準(zhǔn)對于建立一個(gè)新的唾液生物樣本庫至關(guān)重要[5-7]。

1.2.3.4 關(guān)節(jié)液樣本的采集與保存 多種風(fēng)濕病發(fā)病以關(guān)節(jié)滑膜增生為主要病理基礎(chǔ)，患者常伴有關(guān)節(jié)腫脹，所以，采集關(guān)節(jié)液對關(guān)節(jié)局部炎癥等病變分析有重要作用。通過門診或住院醫(yī)師無菌操作取得關(guān)節(jié)液，抽出液體后，要記錄液體數(shù)量，樣本庫留取樣本分裝在2支無菌采集管內(nèi)，其中一個(gè)管不加抗凝劑，另一個(gè)管加適量肝素抗凝用做細(xì)胞學(xué)檢查；將樣本貼好標(biāo)識碼標(biāo)簽，-80 ℃保存。

1.2.3.5 糞便樣本的采集與保存 有文獻(xiàn)證實(shí)，多種風(fēng)濕病發(fā)病與腸道菌群失調(diào)相關(guān)[8]。因此，風(fēng)濕病專病樣本庫樣本也納入了糞便采集。測定腸道菌群一般常用16SrRNA基因序列分析技術(shù)檢測，因此，選擇滅菌封口特定容器，收集2～5 g或2～5 cm3固態(tài)狀(或2～5 mL液態(tài)狀)新鮮糞便，無須離心，樣本分管貼好標(biāo)識碼標(biāo)簽，-80 ℃保存。如果需要測定代謝物則將上法采集新鮮糞便用研缽研碎混勻，取0.5 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL75%甲醇溶液，離心取上清液，加入10%氨水備用，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析。

1.2.3.6 DNA /RNA的提取 按試劑盒要求提取DNA；RNA的提取選用傳統(tǒng)的Trizol法，標(biāo)記，入庫，分別儲于-80 ℃冰箱和液氮罐。在樣本收集到入庫整個(gè)過程中，對從樣本中提取的DNA/RNA樣本，需定期抽查濃度、純度，鑒定合格后可繼續(xù)保存。所有樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.3 臨床資料庫建立與信息采集系統(tǒng)管理 樣本庫管理軟件采用IBIO-GENE V2.2.49.0版本，通過與醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system,HIS)/實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(laboratory information system,LIS)/廣東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)病案統(tǒng)計(jì)管理系統(tǒng)(Guangdong Province medical institutions health record and statistics,MIS)對接,利用存儲設(shè)備，完善管理(包括樣本采集、患者信息、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)信息、用戶信息、統(tǒng)計(jì)輔助等多方面管理)，方便數(shù)據(jù)科研/臨床提取及校正，提高了樣本庫工作效率。實(shí)現(xiàn)對樣本狀態(tài)和使用情況有序化、權(quán)限化、多中心的院級共享安全管理。

1.3.1 臨床資料庫建立與管理 包括：①臨床信息采集；②信息整理入庫；③原始紙質(zhì)臨床資料存放與管理；④出入庫管理；⑤庫存核實(shí)；⑥樣本接收、運(yùn)輸、銷毀、安全管理；⑦云端共享管理。

1.3.2 臨床信息采集管理 將預(yù)錄入樣本的臨床資料信息包括住院號/門診號、性別、姓名(為保護(hù)患者隱私使用英文縮寫)、診斷、家系、個(gè)人史、既往史、病史、實(shí)驗(yàn)室報(bào)告、藥物治療情況、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸等所有信息輸入信息系統(tǒng)內(nèi)。

1.4 質(zhì)控管理 質(zhì)控管理包括質(zhì)控人員管理和樣本質(zhì)控。生物樣本庫的質(zhì)量控制包括流程控制和樣本質(zhì)量檢測。

2 結(jié)果

2.1 樣本收集情況 我院自2014年12月起籌建風(fēng)濕免疫病生物樣本庫，于2014年12月開始收集樣本，截至2019年7月31日，共計(jì)收集風(fēng)濕免疫病病例736人次及52人次健康對照者，主要涉及8個(gè)病種，其中SLE 193人次，RA 149人次，OA 102人次，脊柱關(guān)節(jié)病40人次，骨質(zhì)疏松癥61人次，干燥綜合征52人次，血管炎7人次，結(jié)締組織病120人次。目前收集的788人次樣本中，男性233人次，占29.6%；女性555人次，占70.4%，收集樣本的年齡最小11歲，最大80歲。

2.2 樣本管理

2.2.1 單個(gè)樣本錄入路徑與質(zhì)控 參照SOPS標(biāo)準(zhǔn)，生物樣本庫中樣本的出入庫全程實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化管理，必須按二維條形碼識別定位歸放并由專人負(fù)責(zé)管理。使用生物樣本必須按照流程進(jìn)行申請、審批、取樣。在樣本出庫后管理員需追蹤出庫樣本的基本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，做到對樣本的采集與庫中質(zhì)量的二次監(jiān)管。為確保實(shí)驗(yàn)室全體員工熟悉生物安全法律、法規(guī)，建立生物安全意識，保證相關(guān)工作人員掌握開展工作必需的生物安全知識和技術(shù)，避免實(shí)驗(yàn)室感染，防止實(shí)驗(yàn)室事故，生物樣本庫工作人員需定期接受安全培訓(xùn)和考核。樣本庫收集部分血液、尿液樣本編碼及二維條形碼見圖1。

圖1 生物樣本庫血液、尿液樣本編碼及二維條形碼

因RNA、DNA易降解，存在不穩(wěn)定性，為避免樣本在今后使用時(shí)反復(fù)凍融降解RAN、DNA和影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，應(yīng)當(dāng)盡可能將樣本以最小單位分裝。分裝也同時(shí)是為了提取方便和減少樣本浪費(fèi)。樣本質(zhì)量控制根據(jù)不同樣本情況采取不同手段。例如：液態(tài)樣本(血清、血漿、尿液、關(guān)節(jié)液等)需對其中特定物質(zhì)定期檢測；固體組織如：滑膜成分，由病理專家等共同完成，通過顯微鏡檢查和對核酸/蛋白質(zhì)等大分子檢測進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控包括數(shù)據(jù)、取材處理各個(gè)環(huán)節(jié)時(shí)間記錄、形態(tài)復(fù)檢、生物大分子穩(wěn)定性分析等等。生物樣本庫質(zhì)控每半年進(jìn)行1次，隨機(jī)采樣3份，使用紫外分光光度計(jì)測RNA完整性。數(shù)據(jù)信息安全是生物樣本庫安全的重要組成部分，安全保存采集的數(shù)據(jù)，限定使用者權(quán)限，防止數(shù)據(jù)的非法獲取。每個(gè)接觸生物樣本庫信息系統(tǒng)的工作人員都應(yīng)該簽署一份保密協(xié)議，信息系統(tǒng)自動(dòng)備份。

2.2.2 樣本共同管理 采用IBIO-GENE科研數(shù)據(jù)庫信息管理系統(tǒng)V2.2.49.0版本，實(shí)現(xiàn)樣本儲存、共享信息的可視化管理，同時(shí)具有檢索、歸類等多種功能。2017年，我院獲得深圳市政府“醫(yī)療衛(wèi)生三名工程”立項(xiàng)，成功引進(jìn)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院沈南教授風(fēng)濕病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究團(tuán)隊(duì)。通過數(shù)據(jù)庫聯(lián)網(wǎng)，實(shí)現(xiàn)跨地域、多中心與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科生物樣本庫實(shí)現(xiàn)云共享。通過積極推動(dòng)生物樣本庫利用，避免了“臟庫”、“死庫”發(fā)生。同時(shí)正在進(jìn)一步吸引、擴(kuò)大同行業(yè)合作單位和研究范圍，期望實(shí)現(xiàn)多中心收集標(biāo)本、建立華南地區(qū)生物樣本庫聯(lián)盟，擴(kuò)大和維持研究競爭力、可持續(xù)發(fā)展勢態(tài)。

3 討論

SLE，OA、RA等[9-10]風(fēng)濕免疫病屬于高度異質(zhì)性風(fēng)濕病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，嚴(yán)重影響國民健康與國家經(jīng)濟(jì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國因此每年造成經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)3 200億美元以上。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國僅RA的發(fā)病率達(dá)0.6%～1.0%，自身免疫性風(fēng)濕病患者人數(shù)已超過1億，到2020年將達(dá)2億；而臨床上SLE、RA等風(fēng)濕免疫性疾病目前主要采用抗炎和免疫抑制方法進(jìn)行治療，以糖皮質(zhì)類激素聯(lián)合細(xì)胞毒藥物為主，不良反應(yīng)大，感染已成為風(fēng)濕免疫性疾病致死的首要因素。因此，尋找風(fēng)濕免疫病生物標(biāo)志物、新的治療靶向藥、中西醫(yī)結(jié)合等方向治療成為全球共同關(guān)注問題。隨著治療手段不斷更新，不同類型干細(xì)胞、富血小板血漿、影響自噬相關(guān)通路藥物在OA、SLE等疾病治療中應(yīng)用[11]。專病生物樣本資源是一類重要的生物樣本資源[12],臨床科研要驗(yàn)證醫(yī)療精準(zhǔn)性，建立生物樣本庫、干細(xì)胞庫的作用意義重大。

生物樣本庫模式目前有2類，一類是采用英國模式，即由政府出資組建生物樣本庫；另一類是采用歐盟模式，即建立“分散實(shí)體庫+統(tǒng)一信息庫”的生物樣本庫聯(lián)盟網(wǎng)絡(luò)[13]。國外相關(guān)專病生物樣本庫發(fā)展已經(jīng)積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，值得我們參考。丹麥自2007年啟動(dòng)全國多中心風(fēng)濕免疫病生物樣本庫建設(shè)[14]，目的是促進(jìn)對炎癥性風(fēng)濕病患者進(jìn)行個(gè)性化治療以及新生物標(biāo)志物的鑒定。2011年，歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)合硬皮病試驗(yàn)研究小組[15]建立了一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫，目的是通過隊(duì)列研究開發(fā)系統(tǒng)性硬化癥的新型生物標(biāo)志物和尋求新的治療方法,管理經(jīng)驗(yàn)值得其他地區(qū)風(fēng)濕免疫病生物樣本庫借鑒。

國內(nèi)外現(xiàn)有的生物樣本庫都在積極開展資源共享、互相合作模式，通過共同搭建平臺[16]，解決共享存在的普遍問題：樣本質(zhì)量評估、樣本種類不全、供需雙方信息未及時(shí)更新等[17]。近年來中國在生物樣本庫共享方面有一定的進(jìn)展，以北京生物銀行、國家基因庫聯(lián)盟為代表的生物樣本庫共享網(wǎng)絡(luò)相繼成立，國家規(guī)劃層面也提出了生物樣本庫共享要求和設(shè)想，一些專病樣本庫建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陸續(xù)出臺。我院建立的生物樣本庫主要采用分散實(shí)體庫與統(tǒng)一信息庫結(jié)合模式，通過重點(diǎn)?？茖ｍ?xiàng)經(jīng)費(fèi)維持，保證樣本庫正常運(yùn)營。由于建立規(guī)范專病生物樣本庫與專科遺傳資源、表觀信息、分子流行病學(xué)調(diào)查等相應(yīng)臨床信息關(guān)系密切，在建立風(fēng)濕免疫病生物樣本庫上，按照SOPS組織架構(gòu)、專員管理、嚴(yán)格倫理流程和質(zhì)控管理，推動(dòng)專病生物樣本庫合理化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、共享化發(fā)展。避免采集時(shí)間倉促、采集量不足、信息可信度差等缺點(diǎn)，確保樣本的質(zhì)量和數(shù)量。

2017年7月8日,國務(wù)院印發(fā)《新一代人工智能發(fā)展規(guī)劃》,利用人工智能建立生物樣本庫“云”資源共享平臺的設(shè)想已經(jīng)提出[18]。國外在實(shí)現(xiàn)機(jī)構(gòu)間合作研究方面有很多成功嘗試?yán)?，包括合作的前列腺癌組織資源，賓夕法尼亞州癌癥聯(lián)盟生物信息學(xué)聯(lián)合會，合作乳腺癌組織資源，合作人類組織網(wǎng)絡(luò)，癌癥家族注冊管理機(jī)構(gòu)等，但尚未達(dá)成全球共享平臺[19]。我們通過結(jié)構(gòu)化采集方式、表單設(shè)計(jì)填寫、醫(yī)院HIS/LIS/MIS系統(tǒng)對接、二維碼標(biāo)識掃描規(guī)范臨床數(shù)據(jù)采集流程，通過將工作流程轉(zhuǎn)化存儲生物樣本到電子信息，設(shè)計(jì)并實(shí)施了備份解決方案，確保日常?？粕飿颖編斓母采w范圍，并將備份資料分布到遠(yuǎn)程服務(wù)器或云共享APP上定期進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)、操作系統(tǒng)、參數(shù)等優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)可視化管理，保證樣本臨床信息的完整準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)的完整性、真實(shí)性、統(tǒng)一性，無須增加人員成本和軟件成本。我們與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科姊妹庫共享資源、信息、技術(shù)及人才平臺等，共同承擔(dān)科研項(xiàng)目，實(shí)現(xiàn)地區(qū)?？飘a(chǎn)業(yè)突破。不但有效保護(hù)、合理開發(fā)和充分利用了專病生物資源，而且提高了專科研究水平，還促進(jìn)了專病診治進(jìn)展及實(shí)現(xiàn)惠及民生的醫(yī)療目標(biāo)，具有較大社會經(jīng)濟(jì)效益。多方合作生物樣本庫之間應(yīng)確定統(tǒng)一完整的本體，數(shù)據(jù)集平臺必須有上下級隸屬合作關(guān)系，并成立第三方管理機(jī)構(gòu)監(jiān)管互通模式；應(yīng)用信息管理軟件，使用微軟服務(wù)器及Excel編輯信息，通過嚴(yán)格審核、定制和開放共享網(wǎng)絡(luò)共同管理，推動(dòng)存量資源改造[20]。引入云計(jì)算和遠(yuǎn)端服務(wù)，檢測溫度、安全系統(tǒng)、樣本追蹤；加強(qiáng)頂層設(shè)計(jì)，落實(shí)監(jiān)管、法律、資金和服務(wù)平臺等保障;建立行之有效的生物樣本庫共享利益分配機(jī)制，認(rèn)真貫徹倫理和生物安全保護(hù)。

目前我國生物樣本庫仍面臨一些問題和挑戰(zhàn)。相關(guān)的生物樣本資源不斷積累，卻沒有得到妥善的收集與整理、或者一些生物樣本庫得不到合理利用而成為“臟庫”、“廢庫”、“死庫”。如何實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有生物樣本資源共享，己成為當(dāng)下各國生物樣本庫建設(shè)和發(fā)展所共同面對的難題。生物樣本庫的出現(xiàn)所帶來的一些倫理、法律和社會問題，包括從弱勢群體(臨床上通常是患者)收集捐款的公平性，對捐助方而言的知情同意，向參與者披露數(shù)據(jù)的管理、知識產(chǎn)權(quán)所有權(quán)以及參與方的隱私和安全[21]。由于這些新的問題，研究人員和決策者需要建立新的研究治理體系。

期待以我院風(fēng)濕免疫病生物樣本庫為基礎(chǔ)，聯(lián)合深圳市-廣東省-華南地區(qū)更多合作單位，不斷充實(shí)風(fēng)濕免疫病的病種及系統(tǒng)生物樣本，通過大樣本的關(guān)聯(lián)分析，實(shí)現(xiàn)大數(shù)據(jù)在生物樣本庫的充分價(jià)值體現(xiàn)，將有利于動(dòng)態(tài)縱向觀察風(fēng)濕免疫病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的規(guī)律。下一步將開展干細(xì)胞庫建立和管理，為風(fēng)濕免疫病臨床和基礎(chǔ)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。