廣東口岸結(jié)核分枝桿菌生物樣本庫的建設(shè)

吳 健，張建明，溫 穎，雷 達，吳培豐，高穎龍，王向陽，何洪濤

結(jié)核依然是嚴重威脅人類健康的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示[1]，2017年全球結(jié)核病新發(fā)病例1 000萬，結(jié)核病死亡病例130萬，耐利福平及耐多藥結(jié)核病例55.8萬；中國新發(fā)結(jié)核病例88.9萬，耐利福平及耐多藥結(jié)核病例7.3萬，死亡結(jié)核病例3.9萬,是全球耐多藥結(jié)核最為嚴重的國家之一。到目前為止，人類依然面臨著結(jié)核預(yù)防控制、臨床診療中的諸多瓶頸問題，建設(shè)高質(zhì)量、高標準的菌種生物樣本庫是結(jié)核基礎(chǔ)和臨床研究的基石，對于傳染源追蹤，結(jié)核傳播規(guī)律、結(jié)核耐藥機制研究，診斷試劑研發(fā)，新型治療藥物及疫苗的研制等研究領(lǐng)域都具有重要意義，最終有助于人類實現(xiàn)消滅結(jié)核的終極目標[2]。

廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心實驗室為中華人民共和國廣州海關(guān)所屬結(jié)核病檢測重點實驗室，承擔(dān)廣東口岸出入境人員結(jié)核病疑似患者的實驗室檢測任務(wù)，已在出入境人員中累計分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌近千株，來源于國內(nèi)及20余個國家和地區(qū)的出入境人員，菌種生物學(xué)資源豐富。現(xiàn)將實驗室結(jié)核分枝桿菌生物樣本庫的建設(shè)情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本管理軟件 FreezerPro生物樣本庫管理軟件。

1.1.2 儀器設(shè)備 BACTECTMMGITTM960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)，Baker生物安全柜，Thermo 991超低溫冰箱，超聲振蕩儀，高速離心機，HIRAYAMA高壓滅菌器，BRADY BP IP300耐低溫條碼打印機，移液器。

1.1.3 耗材 凍存盒、凍存管、凍存架、耐低溫條碼、滅菌移液吸頭、15 mL無菌離心管，5 mL離心管。

1.1.4 試劑 羅氏培養(yǎng)基，廣東省結(jié)核病控制中心提供；分枝桿菌生長培養(yǎng)管(mycobacteriagrowth indicator tube,MGIT)，美國Bection Dickinson公司提供；結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒(AccuProbe M.Tuberculosis Complex)，美國Gene-Probe公司提供；血平板，廣州環(huán)凱生物科技有限公司提供；菌種保存液[3]7H9保存液(0.47% 7H9粉劑、20%甘油、10%抗生素混合液)，配制后經(jīng)121 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌，冷卻后分裝至凍存管中4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?H9粉劑及抗生素混合液，美國Bection Dickinson公司提供。

1.1.5 實驗室生物安全等級 廣東國際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核病檢測實驗室為加強型生物安全二級實驗室[4]，已在當(dāng)?shù)匦l(wèi)生主管部門備案。結(jié)核分枝桿菌分離、培養(yǎng)、鑒定及菌種保存等實驗活動均在加強型生物安全二級實驗室內(nèi)完成，所有實驗操作在生物安全柜中進行，確保實驗室生物安全。

1.2 方法

1.2.1 樣本來源 廣州口岸出入境人員中經(jīng)胸部X線檢查或結(jié)核感染T細胞檢測等方法檢出的結(jié)核疑似病例，留取連續(xù)3 d空腹晨痰分別進行檢測，經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株納入菌種庫進行保存。

1.2.2 樣本檢測 痰標本經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH充分消化處理，所獲得沉渣分別進行集菌涂片及金胺O染色，接種羅氏培養(yǎng)基、MGIT培養(yǎng)管各1支置于恒溫培養(yǎng)箱及BACTECTMMGITTM960中進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)陽性樣本進行涂片抗酸染色，抗酸染色陽性者經(jīng)基因探針核酸雜交法進行菌種鑒定，鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群者采用BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)液體比例法進行一線和(或)二線抗結(jié)核藥物敏感性實驗。

1.2.3 樣本信息采集

1.2.3.1 樣本基礎(chǔ)信息 包括病例的性別、年齡、職業(yè)、文化程度、來源地區(qū)、人員類別、旅行史、相關(guān)病史、分離時間、臨床癥狀、臨床治療記錄以及常規(guī)血液生化等檢測指標，錄入樣本管理系統(tǒng)，所有病例的相關(guān)信息收集整理均在收集前獲得知情同意。

1.2.3.2 樣本生物學(xué)信息 包括痰涂片抗酸/金胺O染色結(jié)果、菌落形態(tài)、一線(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)及二線(阿米卡星、卷曲霉素、乙硫異煙胺、KAN卡拉霉素、氧氟沙星、對氨基水楊酸)抗結(jié)核藥物藥敏結(jié)果、利福平耐藥基因rpoB常見耐藥突變、異煙肼耐藥基因katG、inhA常見耐藥突變、MIRU基因分型、Spoligotyping分型等。

1.2.4 樣本制備

1.2.4.1 菌種制備 ①從4 ℃冰箱中取出適當(dāng)數(shù)量的菌種保存管(每株菌分別保存3～4支)，室溫平衡，打印二維碼粘貼備用。②取經(jīng)鑒定的結(jié)核分枝桿菌菌種重新轉(zhuǎn)種至新的MGIT培養(yǎng)管中培養(yǎng)至報告陽性，肉眼觀察培養(yǎng)基背景澄清，結(jié)核桿菌呈顆粒狀分布，即可進行菌種保存。③取MGIT培養(yǎng)管置于渦旋震蕩儀震蕩30～60 s，3 000 r/min離心5 min，棄上清，剩余約1 mL菌懸液充分混勻后平均分裝至準備好的菌種保存液中。④制備好的菌種保存管掃描二維碼錄入樣本管理系統(tǒng)，放入-80℃冰箱指定位置長期保存[3]。

1.2.4.2 DNA制備 混勻MGIT培養(yǎng)管中的菌液，吸取1 mL于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心15 min，棄上清，加入100 μL分子生物級滅菌水重懸；上述制備好的菌液置于95 ℃水浴中滅活20 min，移入超聲振蕩儀中作用15 min后，15 000 r/min離心5 min，吸出上清液，即為所提取的DNA，每支20 μL分裝至3～5支0.5 mL離心管中保存。

1.2.5 樣本的標識與儲存

1.2.5.1 樣本編號標識 登錄FreezerPro生物樣本庫管理軟件，通過樣本號自動生成樣本標識條碼。

1.2.5.2 樣本儲存 樣本儲存按樣本種類、分離時間等分區(qū)儲存于-80 ℃超低溫冰箱中，冰箱溫度實時監(jiān)控。

1.2.6 質(zhì)量控制

1.2.6.1 菌種純度檢測 在FreezerPro軟件中將待抽檢菌種出庫，從冰箱中取出目標菌種，置37 ℃水浴中快速解凍后充分混勻，將菌液用接種環(huán)無菌接種于血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，血平板連續(xù)培養(yǎng)72 h觀察有無雜菌生長。

1.2.6.2 菌種活力檢測 移液器吸取100 μL上述菌懸液接種于中性羅氏培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，定期觀察羅氏培養(yǎng)基，記錄出現(xiàn)肉眼可見菌落的時間及菌落形態(tài)。

1.2.6.3 菌種特性檢測 取1.2.6.2所培養(yǎng)的菌落，進行藥敏試驗或耐藥基因突變檢測，與既往檢測結(jié)果進行比對，是否保持原有特性。

1.2.6.4 DNA質(zhì)量檢測 通過核酸蛋白分析儀檢測所保存DNA的濃度。

1.2.6.5 質(zhì)控頻次 菌種抽檢均以5%的比例按照隨機抽樣的方式每年抽取前一年保存的菌種進行純度、活力及特性的檢測；DNA抽檢以5%的比例按照隨機抽樣的方法每年抽取前一年保存的DNA樣本進行檢測。

1.2.7 菌種庫管理 樣本管理軟件由專人進行設(shè)置維護，定期升級更新；樣本入庫后由專人進行相關(guān)資料收集整理，并導(dǎo)入系統(tǒng)；樣本出庫需經(jīng)負責(zé)人審批，樣本出庫后從使用到廢棄全過程需詳細記錄，確保每份樣本流向清晰，保持管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)與實物庫一致；樣本庫保管采用雙人雙鎖，確保樣本安全；樣本儲存超低溫冰箱溫度進行時實監(jiān)控，確保樣本質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 標識及保存

2.1.1 菌種及DNA標識 樣本標識采用四級編號，包括超低溫冰箱、凍存架、凍存盒及凍存盒內(nèi)位置等相關(guān)信息，對應(yīng)生成每株菌的唯一性二維碼標識及唯一樣本編號(圖1)，菌種與其DNA的編號相對應(yīng)，多管相同的樣本通過分管號進行區(qū)分。通過二維碼可追溯樣本的所有信息資源。所采用條碼標簽為專用耐低溫條碼，耐酸堿、防水、防油污且粘貼牢固不脫落。

圖1 樣本二維碼及編號

2.1.2 保存位置 菌種與DNA分開存放于-80 ℃冰箱不同儲存室中；按分離時間不同分列于不同凍存架中，每個凍存架包含若干凍存盒，樣本則按編號順序存放于相應(yīng)凍存盒中。

2.2 菌種庫構(gòu)成 截至2017年12月，結(jié)核分枝桿菌菌種庫庫存結(jié)核分枝桿菌863株，每株菌含保存菌種3～4支，每支800 μL，含保存DNA 3～5支，每支20 μL。菌種庫菌種來源構(gòu)成及菌種生物學(xué)特性分別見表1，表2。

2.3 菌種庫質(zhì)量抽檢 通過對菌種庫庫存菌種進行抽檢，總體菌種保存狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定，對2株檢出的雜菌污染菌及非結(jié)核分枝桿菌混雜菌進行了剔除、廢棄。

表1 菌種庫菌種構(gòu)成(n=863)

表2 菌種庫菌種生物學(xué)特性(n=863)

3 討論

我國生物樣本庫的收集最早開始于20世紀70年代，但早期的樣本收集存在無序、分散、封閉、缺乏標準化流程、缺乏質(zhì)控體系與信息化管理、臨床資料殘缺不全(尤其是治療與隨訪資料)、倫理學(xué)與相關(guān)法律不健全等問題,導(dǎo)致其所能發(fā)揮的作用非常有限[5]。進入21世紀以來，國內(nèi)生物樣本庫建設(shè)逐漸步入正軌，憑借著人口基數(shù)大、病例資源豐富等優(yōu)勢，逐步建成一批有代表性的生物樣本庫，包括中山大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤資源庫、天津協(xié)和干細胞庫、北京市乙型病毒性肝炎/艾滋病樣本庫等[5]。同時，生物樣本庫建立與運行的技術(shù)標準體系也在逐步形成，2011年，由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會發(fā)布了《生物樣本庫行業(yè)標準》[6]，并推行生物樣本庫的質(zhì)量監(jiān)督檢查，促進了數(shù)據(jù)的可靠性、提高了樣本的使用率，不斷推動了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展[7]。

菌種庫作為生物樣本庫的一個重要部分，對于研究病原體的分子流行病學(xué)特征、遺傳及變異規(guī)律、疾病爆發(fā)的傳染源追溯、耐藥突變機制研究、診斷試劑及疫苗研發(fā)等具有重要意義，但國內(nèi)有關(guān)結(jié)核分枝桿菌菌種庫的文獻報道并不多見，劉志輝等[8-9]、柳正衛(wèi)和丁北川[10]在分枝桿菌菌種庫的系統(tǒng)建設(shè)方面進行了有意義的探討，但國內(nèi)分枝桿菌菌株庫建設(shè)依然存在菌株收集盲目、菌株資料局限和保存方法單一等問題[11]。

國外文獻報道主要有2個結(jié)核分枝桿菌菌種庫，分別是：①TDR-TB結(jié)核分枝桿菌菌種庫(TDR-TB Strain Bank)，由世界范圍內(nèi)多家實驗室共同創(chuàng)立，報道庫存耐藥結(jié)核菌種229株，來源于世界范圍內(nèi)31個國家和地區(qū)，主要應(yīng)用于結(jié)核桿菌耐藥機制研究、結(jié)核及耐藥結(jié)核診斷試劑研發(fā)及跨國結(jié)核參比實驗室能力驗證項目[12]。②FIND結(jié)核分枝桿菌菌種庫(FIND Tuberculosis Strain Bank)，由FIND基金會創(chuàng)建，主要收集耐藥結(jié)核菌株(包括單一耐藥、耐多藥、廣泛耐藥)，所有庫存菌種包含完整的感染者信息及菌種的生物學(xué)信息，主要應(yīng)用于耐藥結(jié)核耐藥機制及新的診斷技術(shù)方法研究[13]。

本實驗室主要承擔(dān)廣東口岸出入境人員結(jié)核病疑似患者的實驗室檢測工作，病例來源包括全國各地的出境人員及來自非洲、東南亞等近20余個國家和地區(qū)的入境人員，病例地域分布廣泛，所感染結(jié)核分枝桿菌菌種生物學(xué)資源豐富，相比國內(nèi)的菌種庫有其獨特之處。鑒于日?？蒲泄ぷ髦兴庥龅臉颖玖餍胁W(xué)資料、臨床資料不全，樣本生物信息資料缺乏，使研究無法深入的窘?jīng)r，吳玲等[14]在對廣州市胸科醫(yī)院庫存的廣州地區(qū)15 854株分枝桿菌菌種的資源組成進行了系統(tǒng)的分析后，也報道約1/4保藏菌株的患者信息資料不完整。因此，我們著力將菌種庫的菌種資源信息建設(shè)作為工作的首要任務(wù)，收集整理詳細的宿主流行病學(xué)資料、臨床資料及菌種生物學(xué)特征信息資料，利用實驗室生物樣本智能管理系統(tǒng)(RuRo FreezerPro)對樣本資料信息進行系統(tǒng)的分類管理，使信息數(shù)據(jù)的錄入、查詢及管理高效而便捷。但比較而言，國外菌種庫[12-13]包含了更為詳盡的菌種生物學(xué)特征信息：包括rpoB、katGinhA、embB、rpsL、rrs、gyrA等耐藥基因序列分析，基因分型甚至全基因組序列等，給菌種庫未來的使用帶來了極大的便利，也節(jié)省了重復(fù)檢測的成本。

經(jīng)過近十年的建設(shè)，本菌種庫目前已累計保存結(jié)核分枝桿菌菌種863株，數(shù)量還在不斷增加。除結(jié)核分枝桿菌臨床分離株外，本菌種庫還保存了標準結(jié)核分枝桿菌菌株：H37Ra(ATCC 25177)1株，參加世界衛(wèi)生組織跨國結(jié)核實驗室網(wǎng)絡(luò)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗?zāi)芰︱炞C樣本30株，參加中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室抗結(jié)核藥物敏感性試驗熟練度測試項目樣本120株。與TDR-TB菌種庫和FIND菌種庫所不同的是，這2個菌種庫側(cè)重于提供不同生物學(xué)特性的標準化菌株，關(guān)注菌種的純度及長期研究的穩(wěn)定性，因而所保存的菌種均來源同一個單一克隆，不一定能夠反應(yīng)其對應(yīng)宿主體內(nèi)結(jié)核種群的所有特征[12]，本菌種庫所保存的是宿主體內(nèi)完整的結(jié)核桿菌種群。

在菌種庫的保存樣本種類方面，本菌種庫除保存分枝桿菌菌種外，還保存了菌種DNA樣本，可直接用于核酸水平的研究工作，并保存了宿主部分血液檢測結(jié)果，在菌種庫的不斷建設(shè)中還可嘗試同時保存宿主的血液或者尿液樣本。TDR-TB菌種庫同時配套建立了TDR-TB樣本庫[15]，主要收集結(jié)核組及具有相同臨床癥候群的非結(jié)核組對照病例的痰液、尿液、血液等各類樣本；FIND菌種庫也保存了同時采集的患者痰液、血液、尿液或唾液樣本[13]，這對于結(jié)核特定領(lǐng)域的深入研究具有重要意義。

本菌種庫的使用主要用于實驗室內(nèi)部的科研工作，包括結(jié)核快速診斷試劑研究、耐藥結(jié)核耐藥突變基因篩查、結(jié)核桿菌全基因組測序等。菌種生物學(xué)信息的獲得也是建立在菌種庫的基礎(chǔ)之上，所獲得的結(jié)果又同時成為樣本庫資源的重要組成部分，兩者相輔相成。TDR-TB庫[12，15]免費為申請機構(gòu)提供用于包括抗體檢測、核酸檢測、結(jié)核抗原靶標、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究領(lǐng)域的菌種，并已取得顯著成果，包括進入臨床應(yīng)用的Xpert MTB/RIF，Cephid檢測技術(shù)平臺等，充分體現(xiàn)了菌種庫的研究價值，實現(xiàn)了資源共享，其運作模式值得國內(nèi)借鑒。

隨著菌種保藏質(zhì)量的不斷提高，數(shù)量的不斷增加，樣本的資源信息不斷豐富完善，將菌種庫逐步建設(shè)成為樣本管理系統(tǒng)化、規(guī)范化，樣本種類多樣化的結(jié)核分枝桿菌生物樣本庫，在滿足自身科研工作的同時，還可將樣本提供給出入境口岸、甚至結(jié)核病防控系統(tǒng)其他實驗室開展相關(guān)科學(xué)研究，共同促進結(jié)核研究領(lǐng)域的不斷進步。