食管癌患者來(lái)源異種移植模型的構(gòu)建及組織學(xué)觀察

王佩文，柏 文，鞠前前，史 輝，蔣茂榮

食管癌是較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2017年，國(guó)家癌癥中心發(fā)布了中國(guó)最新癌癥數(shù)據(jù)，其中食管癌位居第4位[1]。在全世界范圍內(nèi)，食管癌的年平均發(fā)病率為30/100 000，5年生存率為15%～25%。由于多方面的因素(包括飲食、環(huán)境和生活習(xí)慣等)，中國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率最高的國(guó)家。盡管醫(yī)療水平一直在進(jìn)步，食管癌依然是死亡率較高的一種疾病，傳統(tǒng)治療方案(如手術(shù)切除、化療、放療)難以達(dá)到滿意的治療效果[2-3]。

人源腫瘤異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型是指把臨床患者新鮮的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，依靠小鼠的內(nèi)環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)而形成的移植瘤模型。PDX模型基本復(fù)制了患者腫瘤的異質(zhì)性，能較好保留原發(fā)腫瘤的組織病理結(jié)構(gòu)和遺傳特性，因此被認(rèn)為是最接近臨床患者腫瘤的體內(nèi)模型[4]。但是經(jīng)過(guò)傳至第2代的PDX模型，組織學(xué)特性與細(xì)胞形態(tài)是否保留原發(fā)腫瘤組織的病理特性，是否能較好體現(xiàn)原發(fā)腫瘤的特征，仍需要進(jìn)一步研究。本研究旨在研究不同代的移植瘤與初代患者腫瘤病理學(xué)特性有無(wú)明顯差別，以及傳代之后的移植瘤的成瘤速度和表觀差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食管癌組織標(biāo)本 患者來(lái)源的食管癌組織均來(lái)自南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，患者平均年齡70歲?；颊咝g(shù)前均簽署知情同意書(shū)，研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取用SPF級(jí)BALB/c裸鼠9只，體重20～22 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)在南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障環(huán)境內(nèi)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK(蘇)2017-0046]，實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)條件嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程的規(guī)范要求(南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)：20170303-004)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.3 主要試劑 多聚甲醛、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食管癌組織的收集 臨床手術(shù)剛切除的食管癌腫瘤組織，立刻置于提前預(yù)冷的含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基(4 ℃)中，冰上保存運(yùn)輸(0 ℃)。

1.2.2 病理鑒定 食管癌腫瘤組織病理鑒定均由南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第8版TNM分期系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分期[5]。

1.2.3 食管癌PDX模型的建立 收集的食管癌腫瘤組織于實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌超凈臺(tái)中去除腫瘤周?chē)鷫乃澜M織和部分毛細(xì)血管，將部分腫瘤組織在培養(yǎng)基中切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，置于4%的多聚甲醛中固定。裸鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉溶液，劑量為50 mg/kg，取組織塊于套管針內(nèi)，于裸鼠右腋下接種，裸鼠蘇醒前放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，此為食管癌PDX模型初代(P0)。每2～3天觀察成瘤情況，將P0代移植瘤取出后再次接種于裸露皮下生長(zhǎng)的腫瘤為第1代(P1)。待裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)至500 mm3，裸鼠經(jīng)CO2窒息處死，取出腫瘤組織，重復(fù)上述方法，傳代至第2代(P2)，取部分P0、P1、P2代腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，進(jìn)行HE染色并與食管癌患者腫瘤組織進(jìn)行比較。

1.2.4 PDX模型生長(zhǎng)曲線 隔日觀察腫瘤體積及小鼠體重變化，腫瘤體積計(jì)算公式為V=(D×d2)/2(D為腫瘤表面最長(zhǎng)徑，d為腫瘤表面最短徑)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 組織鑒定和HE染色，傳代 將食管癌患者取出的腫瘤組織即初代(P0)以及移植瘤P1，P2代用多聚甲醛固定后，石蠟組織包埋，連續(xù)厚度6 μm組織切片并HE染色，嚴(yán)格按照HE染色試劑盒進(jìn)行染色流程。光鏡下觀察比較病理形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤大體表觀形態(tài) 3名食管癌患者腫瘤組織接種裸鼠皮下后，均生長(zhǎng)出近似于球形的移植瘤(P0代)。將其中1名患者P0代移植瘤取出后，再次接種于3只裸鼠皮下，大約1個(gè)月后，又生長(zhǎng)出比P0代更近似于球形的移植瘤(P1代)。P0代與P1代具體移植瘤大體表觀態(tài)見(jiàn)圖1。P0代與P1代移植瘤表觀形態(tài)無(wú)明顯差異。

圖1 移植瘤大體表觀形態(tài)觀察

2.2 食管癌PDX模型移植瘤生長(zhǎng)情況 食管癌PDX模型P0代移植瘤生長(zhǎng)較慢，第10天時(shí)裸鼠皮下才出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的小包，第20天時(shí)小包長(zhǎng)成綠豆大小(直徑約為0.3 cm)，第30天時(shí)長(zhǎng)成黃豆大小(直徑約為0.5 cm)，第40天時(shí)已長(zhǎng)成明顯的移植瘤。對(duì)食管癌PDX模型P0代、P1代和P2代移植瘤的瘤體體積進(jìn)行測(cè)量，繪制生長(zhǎng)曲線。見(jiàn)圖2A、2B和2C。以瘤體體積達(dá)到500 mm3時(shí)所需的天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，P0代移植瘤達(dá)到500 mm3時(shí)，約需要60 d；P1代只需要不到40 d；而P2代只需要20 d左右(圖2D)。隨著食管癌PDX模型移植瘤的傳代，瘤體的生長(zhǎng)速度明顯加快。

2.3 食管癌PDX模型移植瘤HE染色光鏡觀查結(jié)果 通過(guò)HE染色，觀察比較食管癌PDX模型移植瘤病理形態(tài)變化。結(jié)果顯示，P0代、P1代、P2代移植瘤光鏡下組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似，沒(méi)有出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變(圖3)。

A：P0代移植瘤生長(zhǎng)曲線；B：P1代移植瘤生長(zhǎng)曲線；C：P2代移植瘤生長(zhǎng)曲線；D：瘤體體積達(dá)到500 mm3時(shí)所需的天數(shù)注：與P0代比較，**P<0.01圖2 PDX模型移植瘤生長(zhǎng)情況

圖3 食管癌PDX模型移植瘤HE染色光鏡觀查結(jié)果

3 討論

PDX模型的構(gòu)建成功與否與原發(fā)腫瘤的惡性程度、移植小鼠的類(lèi)型、移植部位等因素有關(guān)[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，卵巢癌腎包膜移植PDX SCID小鼠(T,B細(xì)胞均缺陷)模型成功率高達(dá)95%[7]，非小細(xì)胞性肺癌皮下移植PDX SCID小鼠模型成功率為45%[8]，而乳腺癌皮下移植PDX模型僅為13%[9]。本研究采用T細(xì)胞缺陷的裸鼠，裸鼠右腋下接種，食管癌PDX模型構(gòu)建成功率較高。由于食管癌PDX模型相關(guān)報(bào)道較少，其應(yīng)用價(jià)值較高。

本研究選用3名臨床食管癌患者，且全部癌組織均能在裸鼠皮下成瘤。P0代成瘤周期約為60 d(以腫瘤體積達(dá)到500 mm3為標(biāo)準(zhǔn))，P1代為40 d，P2代為20 d。隨著傳代次數(shù)增加，其成瘤速度加快。這一結(jié)果與頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌PDX模型和涎腺腺樣囊性癌PDX模型構(gòu)建相似[10]。

以往的研究表明，腫瘤PDX模型在病理組織結(jié)構(gòu)、基因譜表達(dá)水平、基因的拷貝數(shù)均與原移植瘤保持高度的一致性[11]。在本研究中，除了建立起食管癌的PDX移植瘤模型，還比較它們轉(zhuǎn)代后的生長(zhǎng)速度。為了檢驗(yàn)食管癌PDX模型在生長(zhǎng)過(guò)程中是否會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化，我們做了HE染色，觀察比較病理形態(tài)變化。結(jié)果顯示，隨著食管癌的傳代，未發(fā)現(xiàn)病理組織形態(tài)學(xué)的改變，證實(shí)了食管癌PDX模型保持了原發(fā)腫瘤的病理組織結(jié)構(gòu)。構(gòu)建的食管癌PDX模型有利于快速研究人原發(fā)食管癌相關(guān)特性。

PDX模型可用于精準(zhǔn)醫(yī)療中，建立腫瘤患者個(gè)性化的PDX模型有利于開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)以患者腫瘤基因?yàn)榘邢虻闹委煵呗訹12]。但目前仍存在諸多問(wèn)題，如連續(xù)傳代出現(xiàn)原發(fā)腫瘤特征丟失的問(wèn)題[13]，需要進(jìn)一步解決。