具核磁共振成像功能的可再生介孔硅作為抗腫瘤藥物新型載體的性能研究

喻兆陽，薛慧穎，鐘夢(mèng)菊

癌癥是人類健康的主要威脅，癌癥的藥物治療發(fā)展迅速[1]。然而大部分抗腫瘤藥物毒性高，具有較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，使用納米載體作為遞藥系統(tǒng)使藥物靶向至腫瘤組織繼而釋放，從而減少藥物對(duì)正常組織的損傷成為癌癥藥物研發(fā)的重要手段[2]。

對(duì)比增強(qiáng)核磁共振成像(magnetic resonance ima-ging，MRI)是一種分辨率高、成像深度廣的無創(chuàng)影像檢查手段，廣泛應(yīng)用于各類臨床疾病診斷中[3-4]。而常用的MRI對(duì)比劑主要是T1加權(quán)成像釓螯合物釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)。此類對(duì)比劑大多存在半衰期短，不良反應(yīng)較多且有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定而無法實(shí)現(xiàn)靶向分子診斷和治療的缺點(diǎn)[5]。

而無機(jī)納米材料介孔二氧化硅納米粒(mesoporous silicana noparticle，MSN)因其具有極大的比表面積、高度均勻可控的介孔孔道、容易進(jìn)行功能化修飾以實(shí)現(xiàn)有效荷載、靶向遞送功能被公認(rèn)為是一種優(yōu)秀的治療診斷納米系統(tǒng)[6-7]。研究表明，水稻殼中約含有10%～21%的無定型水合二氧化硅，煅燒后其灰分中二氧化硅含量高達(dá)90%，是一種良好的硅源[8-9]。因此，為符合當(dāng)今綠色環(huán)保和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的要求，本研究組使用稻殼為硅源并摻入釓離子(Gd3+)合成了一種新型再生多功能介孔硅納米材料(gadolinium-containing renewable MSN,rMSN-Gd)。在前期研究基礎(chǔ)上，以抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)為模型藥物，設(shè)計(jì)構(gòu)建具M(jìn)RI功能的載DOX介孔硅納米粒(DOX-rMSN-Gd)，以期提高腫瘤胞內(nèi)藥物濃度、增強(qiáng)抗肝癌細(xì)胞活性并同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的影像診斷，為腫瘤的診斷治療一體化的探索提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人肺癌A549細(xì)胞株、人肝癌HepG2細(xì)胞株，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。SPF級(jí)BALB/c裸鼠[SCXK(京)2014-0004]6只，雌性，4～6周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 試劑及儀器 水稻殼(實(shí)驗(yàn)室自備)；氫氧化鈉、溴化十六烷基三甲銨(CTAB,98%)、二氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三氯化釓六水合物(美國Alfa Aesar公司)，其他試劑均為分析提純。高溫反應(yīng)爐(美國Lindberg Blue公司/300 ℃)；JEM-2100型透射電鏡(日本JEOL公司)；動(dòng)態(tài)散射光粒度儀(美國Brookhaven Instruments公司)；比表面孔徑分布測(cè)定儀(美國Boynton Beach公司)；S300磁共振成像系統(tǒng)(德國Bruker公司)；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(德國Spectro公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國Termo Scientific公司)；紫外-可見光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)。

1.3 再生多功能介孔硅的制備

1.3.1 稻殼的處理 按照文獻(xiàn)[8]方法改良后進(jìn)行，取適量稻殼，2 mol/L的鹽酸加熱回流4 h，棄去鹽酸，用蒸餾水洗滌至中性，干燥煅燒，即得白色二氧化硅粉末。取3.8 g二氧化硅粉以及1 g的氫氧化鈉加入38 mL的水里，加熱回流至粉末全部溶解，過濾得透明澄清液，即為硅酸鈉溶液，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 rMSN與rMSN-Gd的制備 將1 g CTAB溶解于93 mL的超純水中，加入0.1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液室溫混和攪拌1 h，逐滴滴加3 mL所制備的硅酸鈉溶液后，分別迅速加入3 mL超純水與3 mL含41.6 mg GdCl3·H2O的水溶液，于80 ℃攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，離心收集沉淀，用蒸餾水洗滌3次，干燥、煅燒后除去模板劑CTAB，即得rMSN與rMSN-Gd。

1.3.3 DOX-rMSN-Gd的制備 載藥過程采用吸附法進(jìn)行。精密量取1 mL 1 mg/mL的rMSN-Gd納米粒水溶液，在劇烈攪拌中加入5 mg/mL的DOX水溶液1 mL超聲2 min，繼續(xù)攪拌吸附24 h至平衡。去除上清并洗滌多余游離DOX，即得DOX-rMSN與DOX-rMSN-Gd納米粒，最后加1 mL超純水重懸備用(圖1)。

圖1 載鹽酸阿霉素含釓可再生介孔硅納米粒(DOX-rMSN-Gd)合成示意圖

1.4 形態(tài)與表征

1.4.1 透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡成像 取10 μL rMSN輕滴到銅網(wǎng)吸附30 min。去除多余的液體，烘干，置于透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察；同時(shí)將樣本懸浮液滴在樣本臺(tái)上，干燥去除水分使rMSN粉末附在樣本座上，導(dǎo)電處理后，置于掃描電子顯微鏡下觀察，記錄rMSN-Gd的形貌特征、大小及表面特性。

1.4.2 水合粒徑和Zeta電位測(cè)定 開啟Zeta Plus動(dòng)態(tài)散射光粒度儀預(yù)熱15 min后，取100 μL rMSN-Gd樣本用去離子水稀釋至3 mL，置于粒度儀中測(cè)量其水合粒徑和Zeta電位。

1.4.3 元素含量分析 分別稱取1 mg rMSN及rMSN-Gd，加入足量氫氟酸，待納米粒子溶解完全后，用去離子水稀釋至10 mL，最后用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測(cè)納米粒中釓元素的含量。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 溶血試驗(yàn)檢測(cè)生物相容性 收集適量新鮮的血液樣本，4℃ 1 500 r/min離心10 min，洗凈，以磷酸緩沖液(phosphate bufler saline，PBS)重懸得濃度為5×108/mL的紅細(xì)胞。將4 mL rMSN-Gd與商用造影劑二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)分別與同體積紅細(xì)胞37 ℃孵育1 h。并使用1%的Triton X-100和PBS分別作為陽性和陰性對(duì)照。離心分離后，使用酶標(biāo)儀于541 nm下檢測(cè)，并計(jì)算溶血率。溶血率=(樣本OD值-陰性組OD值)/(陽性組OD值-陰性組OD值)。

1.5.2 體外MRI成像 取適量rMSN-Gd納米粒子，配置成濃度為15.625、62.5、125和250 μg/mL溶液于EP管中，置于MRI儀中進(jìn)行成像。掃描參數(shù)：TR/TE=300 ms/10.6 ms，視野FOV=7 cm，NEX=1，層厚為2.00 mm，矩陣為256×256條件下。

1.5.3 荷瘤裸鼠體內(nèi)MRI成像 本研究按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范進(jìn)行。在6只BALB/c裸鼠腋背部接種人宮頸癌Hela細(xì)胞，至皮下移植瘤直徑增長(zhǎng)至1.0～1.2 cm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為2組，每組3只。實(shí)驗(yàn)組靜脈注射10 mg/mL的rMSN-Gd懸浮液0.2 mL，對(duì)照組注射同樣體積PBS溶液。然后分別于注射30 min后，置于MRI儀下成像。

1.5.4 載藥量的測(cè)定 采用紫外分光光度法。取上述制備好的DOX-rMSN-Gd 100 μL于5 mL EP管中，加入100 μL 4% HF混合均勻，40 ℃反應(yīng)過夜，將HMSN中的DOX完全釋放，在加入于紫外480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度從而得到100 μL中的DOX載藥量。載藥量=測(cè)得DOX含量/(測(cè)得DOX含量+HMSN總量)。

1.5.5 體外釋放度研究 體外DOX釋放實(shí)驗(yàn)采用透析法，按2015年版《中國藥典》釋放度測(cè)定法步驟進(jìn)行，分別以30 mL 10 mmol/L PBS(pH7.4與pH 5.0)為溶出介質(zhì)，以100 r/min轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌，溫度為(37.0±0.5)℃，并在在1、3、5、8、12、24、30、48和72 h抽取介質(zhì)用UV分光光度計(jì)檢測(cè)PBS中DOX的濃度。

1.5.6 細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h，分別加入DOX-rMSN-Gd溶液和游離DOX水溶液1μL(DOX濃度為1 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1 h或6 h，除去培養(yǎng)基，洗滌。用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，以DAPI染核并用PBS清洗，于熒光倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞的攝取情況。

1.5.7 體外抗腫瘤活性檢測(cè) 將密度為5×103/孔的A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞種在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含不同藥物濃度的游離DOX與DOX-rMSN-Gd培養(yǎng)基1 μL，每組包含3個(gè)復(fù)孔。孵育48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。隨后棄去上清液，向每孔中加入100 μL的DMSO溶液并振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 再生多功能納米粒的制備與初步表征 動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量結(jié)果表明，合成的rMSN納米粒粒徑均一，平均水合粒徑253 nm。加入釓元素之后或裝載藥物DOX后，納米粒水合粒徑未發(fā)生顯著變化，Gd3+的加入對(duì)納米載體的粒徑大小分布無顯著影響。摻雜Gd3+后，納米粒的Zeta電位顯著上升，這是因?yàn)閞MSNs本身帶負(fù)荷而Gd3+帶正電荷，故Gd3+加入后中和了rMSNs本身的電荷屬性致使其電位升高，初步證實(shí)釓元素?fù)诫s至納米粒中。使用ICP-AES測(cè)量構(gòu)建的3種納米粒中釓元素含量，結(jié)果表明rMSN未見測(cè)出釓元素(低于檢測(cè)限)，而rMSN-Gd與DOX-rHMSN-Gd中均可檢測(cè)到含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.7%左右釓元素，這進(jìn)一步確證Gd3+成功摻雜至納米粒中。以分光光度法測(cè)定DOX-rHMSN-Gd納米粒的載藥量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rMSN-Gd的載藥量可達(dá)(15.29±0.33)%。

表1 rMSN、rMSN-Gd與DOX-rHMSN-Gd的表征結(jié)果

2.2 透射電子顯微鏡以及掃描電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡結(jié)果表明(圖2A)，rMSN呈規(guī)則球形，分散性良好，粒徑分布均一，約為150 nm；掃描電鏡結(jié)果表明(圖2B)，rMSN表面具規(guī)則排列的介孔結(jié)構(gòu)。

圖2 rMSN的透射電鏡(A)與掃描電鏡(B)顯微結(jié)構(gòu)

2.3 細(xì)胞生物相容性分析 通過溶血實(shí)驗(yàn)來測(cè)定所構(gòu)建納米載體的生物相容性。結(jié)果顯示1 mg/mL與10 mg/mL rMSN-Gd與商用造影劑Gd-DTPA對(duì)細(xì)胞溶血率無明顯差異，證實(shí)納米材料rMSN-Gd有良好的生物相容性(圖3)。

圖3 溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rMSN-Gd的生物相容性

2.4 體外與體內(nèi)移植瘤MRI成像 體外MRI結(jié)果表明(圖4A)，T1影像的顯影強(qiáng)度隨著材料的濃度升高而升高，其擁有良好MRI的正造影特性。

納米材料rMSN-Gd靜脈注射至荷瘤BALB/c裸鼠體內(nèi)后，可觀察到較對(duì)照組相比荷瘤處(紅圈的位置)MRI成像明顯的變亮；證實(shí)rMSN-Gd在體內(nèi)也可進(jìn)行MRI顯影(圖4B)。

圖4 rMSN-Gd體外(A)與荷瘤小鼠體內(nèi)(B)的MRI成像特征

2.5 體外釋放度實(shí)驗(yàn) 體外模擬了在生理環(huán)境(pH 7.4)和腫瘤的微環(huán)境(pH 5.0)中DOX-rMSN-Gd納米粒DOX的釋放特征，圖5。

圖5 DOX-rMSN-Gd納米粒的體外釋放曲線圖(n=3)

在pH 7.4人工模擬生理環(huán)境下，DOX-rMSN-Gd納米粒中DOX的釋放相對(duì)較慢，而在pH 5.0模擬腫瘤的微環(huán)境的酸性介質(zhì)中，DOX從納米粒中釋放速率變快，提示合成的再生多功能納米粒DOX-rMSN-Gd可控制藥物釋放。在酸性腫瘤環(huán)境中，其可實(shí)現(xiàn)藥物的較快釋放，使得藥物實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的迅速釋藥，發(fā)揮藥效。

2.6 細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn) 在HepG2細(xì)胞中觀察其對(duì)藥物的攝取情況，使用熒光顯微鏡在200倍放大的條件下對(duì)其進(jìn)行觀察，其中紅色熒光為DOX，藍(lán)色熒光為DAPI，結(jié)果表明納米粒rMSN-Gd能很好的被細(xì)胞攝取，在1 h時(shí)DOX就可夠達(dá)到較好的攝取量，8 h能夠大量攝取且納米粒藥物能在細(xì)胞胞內(nèi)較好擴(kuò)散，圖6。

注：圖中標(biāo)尺為100 μm，n=3圖6 rMSN-Gd攜載DOX進(jìn)入HepG2細(xì)胞熒光顯微圖

2.7 納米藥物的體外抗腫瘤活性結(jié)果分析 如圖7所示，處理48 h后，在A549與HepG2中不同濃度DOX-rMSN-Gd的細(xì)胞毒性均高于游離DOX(P<0.05)。游離DOX、DOX-rMSN-Gd抑制A549與HepG2細(xì)胞的IC50值分別為0.802 μg/mL與0.242 μg/mL(P<0.05)；0.352、0.08 μg/mL(P<0.05)，即納米粒對(duì)A549細(xì)胞的毒性高于HepG2細(xì)胞，提示再生功能性納米粒DOX-rMSN-Gd具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性且對(duì)肝癌細(xì)胞具有更好療效。

圖7 DOX-rMSN-Gd納米粒體外抗腫瘤活性結(jié)果

3 結(jié)論

目前，納米材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛[10-14]。其中，無機(jī)納米材料介孔硅具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表面積非常大、生物兼容性良好、毒性極低等的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤診斷治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

研究表明，癌細(xì)胞的不斷增殖致使其血管內(nèi)皮細(xì)胞的排列不緊密，產(chǎn)生10～1 000 nm的間隙(正常血管間隙為5～10 nm)，導(dǎo)致血管的通透性增加[15-16]。粒徑為20～200 nm納米粒子可以通過腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)滲透穿越血管累積在癌組織，同時(shí)癌組織缺乏正常的淋巴網(wǎng)絡(luò)。因此，當(dāng)納米粒子經(jīng)由血液循環(huán)累積在癌組織之后，便很難經(jīng)由正常的淋巴網(wǎng)絡(luò)離開，而延長(zhǎng)其累積在癌組織的時(shí)間，因而納米顆?？赏ㄟ^EPR效應(yīng)靶向腫瘤組織。

本研究制備的稻殼再生介孔硅納米材料DOX-rMSN-Gd分散性良好，平均粒徑約為150 nm，其表面具有序密集分布的介孔且生物相容性良好。研究證實(shí)了該材料可同時(shí)作為MRI顯影劑與藥物納米載體，實(shí)現(xiàn)診斷治療一體化。該材料作為顯影劑，較一般顯影劑其具有EPR介導(dǎo)的靶向性，可靶向聚集于腫瘤部位，從而減少其用量降低了其對(duì)正常組織的影響；作為納米藥物載體，其有一定的酸敏感性與腫瘤的微酸環(huán)境相適應(yīng)，使得藥物實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的集中釋藥，較游離藥物具有更好活性，有效提高了藥物治療效率。

綜上所述，稻殼再生多功能納米材料DOX-rMSN-Gd作為具標(biāo)靶性的智能型顯影劑與智能納米藥物傳遞系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)診斷治療一體化上有良好的應(yīng)用前景。