正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選咳喘合劑的提取工藝

婁成龍 王 瑩 沈曉春 杜 靜

咳喘合劑是杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由蜜麻黃、蜜款冬花、蜜紫菀、浙貝、黃芩、前胡、甘草等12 味中藥組成，具有宣肺平喘，止咳化痰的功效，臨床用于小兒急慢性支氣管炎、哮喘、過(guò)敏性咳嗽及上呼吸道感染、感冒后癢咳等癥。為了規(guī)范咳喘合劑的提取工藝，確保制劑的療效，根據(jù)處方中藥物各組分的理化性質(zhì)及藥理特點(diǎn)，結(jié)合中醫(yī)臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)咳喘合劑進(jìn)行了提取工藝的優(yōu)選研究，為咳喘合劑的制備提供依據(jù)[1-2]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀 器 AL204 型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司)；R502B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；SHB-Ⅲ-A 型循環(huán)水式真空泵（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）；HH6 型恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）；2F-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；U3000 型美國(guó)戴安液相色譜（戴安中國(guó)有限公司）。

1.2 試 藥 咳喘合劑（批號(hào)180711）；飲片：丹參（批號(hào)171108），甘草（批號(hào)170717），蜜紫菀（批號(hào)171221），黃芩（批號(hào)171112），桑白皮（批號(hào)171225），燀苦杏仁（批號(hào)170305），蜜款冬花（批號(hào)180615），焦六神曲（批號(hào)180529），前胡（批號(hào)180323），浙貝母（批號(hào)180328），炒紫蘇子（批號(hào)161013），均來(lái)自浙江惠松制藥有限公司；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110715-201720，純度93.5%），甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷HPLC 含量測(cè)定方法的建立[3]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速:1.0mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：稱取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.01857mg/mL 的黃芩苷對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密量取本品5mL，置100mL 容量瓶中，加70%乙醇適量超聲處理（250W，40kHz）30min，放冷，定容至刻度，搖勻，精密量取續(xù)濾液1mL 置10mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45un 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 專屬性試驗(yàn) 按咳喘合劑處方比例及工藝，同法制成不含黃芩的陰性樣品，精密吸取黃芩苷對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明陰性樣品溶液無(wú)干擾，方法專屬性良好。見(jiàn)圖1-3。

圖1 黃芩苷對(duì)照品高效液相色譜圖

圖2 咳喘合劑樣品色譜圖

圖3 陰性對(duì)照色譜圖

2.1.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下黃芩苷照品溶液。逐級(jí)稀釋共得5 份對(duì)照品溶液系列，濃度依次為：0.01857μg/mL、0.09285μg/mL、0.14856μg/mL、0.18570μg/mL、0.22284μg/mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取上述對(duì)照品溶10μL 注入液相色譜儀。以峰面積（Y）對(duì)濃度（μg/mL，X）線性回歸，回歸方程：Y=3，502.536X-3.380，相關(guān)系數(shù)：R2=1.000，在0.01857～0.22284mg/mL 范圍內(nèi)，對(duì)照品的峰面積與進(jìn)樣濃度有良好的線性關(guān)系。

2.1.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定黃芩苷RSD 為0.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性考察 取咳喘合劑（批號(hào)180711），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0，2，4，8，12，24h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，黃芩苷RSD為0.46%（n=6），表明供試品溶液在24h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品咳喘合劑（批號(hào)180711），按“2.1.2”項(xiàng)下的方法，制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，以黃芩苷為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.34%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一供試品咳喘合劑（批號(hào)：180711），按“2.1.2”項(xiàng)下的方法，制備6 份供試品溶液，分別加入一定量黃芩苷對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算得平均回收率為100.73%，RSD 為1.38%（n=6），加樣回收率良好。

2.2 出膏率的測(cè)定[4]精密量取各實(shí)驗(yàn)的咳喘合劑煎液適量置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，計(jì)算出膏率。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[5-7]按處方比例稱取蜜麻黃、蜜款冬花、蜜紫菀、浙貝、黃芩、前胡、甘草等藥材共9份，每份106g，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時(shí)間和煎煮溫度進(jìn)行考察，各因素水平（見(jiàn)表1），采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2），方差分析見(jiàn)表3。

表1 考察因素及水平

表2 正交試驗(yàn)表L9（34）及其試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 由表3 可見(jiàn)，影響煎煮效果的因素順序?yàn)椋篊＞D＞A＞B。選擇偏差平方和最小的因素B（煎煮時(shí)間）為誤差項(xiàng)，C（煎煮次數(shù)）有顯著性差異，A（加水量）和D（溫度控制）無(wú)顯著性差異。綜合分析得最佳煎煮工藝為A3B2C3D3，即加水量12（10，10）倍，提取時(shí)間1（0.5，0.5）h，提取3 次，100℃煮沸?？紤]大生產(chǎn)的能耗問(wèn)題及第3 煎的效價(jià)比，實(shí)際生產(chǎn)提取2 次，第1 次1h，第2 次0.5h，100℃煮沸，且由于加水量不是顯著性因素，故實(shí)際生產(chǎn)加水量第1 次10 倍，第2 次8 倍，即優(yōu)選煎煮工藝為A2B2C2D3。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件提取處方量的各味藥材，按照優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定黃芩苷含量和出膏率，結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)驗(yàn)證結(jié)果要進(jìn)行總結(jié)分析：由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黃芩苷平均含量為80.202mg/g，RSD 值0.79%；平均出膏率為30.47%，RSD 值0.57%。說(shuō)明優(yōu)選出的最佳工藝參數(shù)重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

咳喘方原為草藥的水煎方，對(duì)小兒咳喘在臨床上已取得良好的療效。中藥合劑可發(fā)揮中藥的綜合作用，吸收快、奏效迅速、可批量生產(chǎn)；既保留傳統(tǒng)湯劑起效快的特點(diǎn)，又克服其服用、攜帶不便的缺點(diǎn)，省去臨時(shí)配方和煎煮的麻煩，同時(shí)改善口感?？却蟿┑闹苽溥x用水作為提取溶劑，可以最大程度保留原湯劑的煎藥方式，同時(shí)還可以避免物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變的風(fēng)險(xiǎn)。

由于咳喘合劑的服用人群是兒童，而該方中主要由苦杏仁、黃芩、浙貝等多種味苦的中藥組成，加蜂蜜不僅可以調(diào)和口感，其補(bǔ)氣益肺，潤(rùn)肺止咳的功效[8]也與咳喘合劑的主治功效相近，可以起到協(xié)同增效的作用，故用它作為矯味劑。同時(shí)，為了便于保存，在符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的前提下，選用了羥苯乙酯作為防腐劑，提高抑菌防腐的效力[9]。

在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾以君藥麻黃[10]中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，君藥炒蘇子中的迷迭香酸作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，但在成品中含量都很低，均低于萬(wàn)分之二；而黃芩中的黃芩苷在成品中含量較高，為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，故以黃芩苷含量（mg/1g 黃芩飲片）為考察指標(biāo)；此外，中藥是通過(guò)組方配伍產(chǎn)生相應(yīng)的功效，其有效成分復(fù)雜多樣，故以出膏率作為優(yōu)選工藝的另一個(gè)參考指標(biāo)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選出最佳煎煮工藝。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，咳喘合劑的最佳制備工藝為處方飲片加水煎煮2 次，第1次1h，第2 次0.5h，加水量，第1 次10 倍，第2 次8倍，濾過(guò)，合并煎液濃縮，添加蜂蜜和羥苯乙酯，靜置過(guò)夜，濾過(guò)，灌裝，滅菌即得。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝合理、穩(wěn)定、可行，可用于咳喘合劑的生產(chǎn)制備。