肺積湯對Lewis 肺癌裸鼠移植瘤新生血管的影響

張麗婷 劉賢忠 宋 康 陳 芳

肺積湯是國家級名老中醫(yī)、浙江省中醫(yī)院宋康教授治療肺癌的基礎經(jīng)驗方，臨床多加減應用于肺癌的治療，每每取得良效。為進一步確定其療效及起效機制，本研究采用Lewis 肺癌小鼠模型觀察肺積湯的抑瘤作用，及其對移植瘤血管生成的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級4～6 周齡、體質量（20±2）g BALB/c 雄性裸鼠30 只（購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK2013-0016）；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度（23±1）℃，濕度50%～60%，光照時間12h 光/12h 暗，水和飼料無限制供應。

1.2 細胞株 鼠源性Lewis 肺癌VEGF 高表達細胞株（山東省醫(yī)學科學院提供）。

1.3 藥物及配置 肺積湯（龍葵、蛇莓各9g，半邊蓮、半枝蓮、蛇舌草各30g），購于浙江省中醫(yī)院，由浙江中醫(yī)藥大學中藥制劑室制成流浸膏，含生藥1g/mL。按《醫(yī)學實驗動物學》計算小鼠等效用藥劑量[1]（20g小鼠與60kg 成人的換算系數(shù)為12.33）。

1.4 主要試劑及儀器 免疫組化VEGF-A 檢測盒（美國protein 公司，批號19003-1-AP）；VEGF-A ELISA 試劑盒（美國R&D Systems 公司，批號MMV00）；MICROM HM340E 石蠟切片機（德國MICROM 公司）；Leica HI120 型攤片機（德國LEICA公司）；Leica DMLB2 型顯微鏡攝像機（德國LEICA公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 復蘇轉染綠色熒光的裸鼠Lewis 肺癌細胞株，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)傳代3～4代至對數(shù)生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化，1000rpm/min 離心5min 去上清，計細胞數(shù)，用PBS 稀釋至2×106/mL 細胞濃度0.2mL/只，分別接種于裸鼠左側腋下。接種后第5 天左側腋下可及大小均一的腫塊即造模成功。

2.2 藥物干預 造模成功后應用隨機數(shù)字表法將30 只裸鼠隨機分為生理鹽水組、肺積湯組和貝伐單抗組，每組10 只。生理鹽水組裸鼠給予0.9%生理鹽水0.4mL/只，灌胃，1 天1 次；肺積湯組裸鼠給予肺積湯混懸液（生藥含量1g/mL）按22.2mg·kg-1，調整至0.4mL/只，灌胃，1 天1 次；貝伐單抗組給予貝伐單抗15mg·kg-1，調整至0.2mL/只，腹腔注射，1 周2 次，持續(xù)用藥21 天。

2.3 標本獲取 給藥結束后，予10%水合氯醛（0.3mL/100g）皮下注射，摘左側眼球取血1.5～2mL，冰上靜置、離心取上清液分裝，于-20℃冰箱中保存。采血結束后，分離皮下瘤，取兩側肺組織，4%多聚甲醛浸泡固定24h，HE 染色及免疫組化檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1 一般情況 全程記錄各組裸鼠精神狀態(tài)、活動度、體質量、皮下瘤大小、皮脂等動態(tài)變化。腫瘤體積計算公式：腫瘤長徑（A）和垂直橫徑（B），按公式V=A×B2/2 計算腫瘤體積。

2.4.2 病理切片 標本浸泡于4%多聚甲醛中，置于-20℃冰箱，24h 后取材固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、行HE 染色，樹膠封片，鏡下觀察。

2.4.3 免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟，抗原修復，3%雙氧水室溫孵育，PBS 沖洗，10%血清封閉，嚴格按照說明書操作，加一抗，PBS 沖洗，加二抗，PBS 沖洗，滴加鏈霉卵白素工作液，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照。分別測定血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）的表達，計數(shù)微血管密度（MVD）。VEGF-A 蛋白染色棕色為陽性提示。MVD 的計數(shù)原則參照文獻[2]。

2.4.4 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）常溫解凍冰凍血清、組織上清液標本，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行，按采集的數(shù)據(jù)得出標準曲線，計算各自的OD 值。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均以（±s）表示，符合正態(tài)性和方差齊性多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD 或SNK 法，方差不齊時數(shù)據(jù)組間比較用Dunnett’s 法，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組瘤體積、瘤重比較 與生理鹽水組比較，肺積湯組荷瘤裸鼠，皮下瘤生長緩慢，體積小，無明顯潰破壞死，皮膚褶皺、活動力下降等惡病質程度均較生理鹽水組及貝伐單抗組輕，解剖后觀察皮下瘤與周圍組織粘連少，測得瘤重及體積為貝伐單抗組最小，肺積湯組次之，生理鹽水組最大。見表1。

表1 各組瘤體積、瘤重（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；與肺積湯組比較，△P＜0.05；生理鹽水組：0.9%生理鹽水0.4mL/d 灌胃；肺積湯組：22.2mg·kg-1·d-1 肺積湯灌胃；貝伐單抗組：貝伐單抗15mg·kg-1 腹腔注射，1 周2 次

3.2 皮下瘤病理切片 生理鹽水組大鼠皮下移植瘤胞核固縮壞死最多，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，并可見較多散亂紅細胞，間接反映血管滲透性較高，肺積湯組和貝伐單抗組差異不大，見插頁圖1。

3.3 各組瘤組織微血管密度比較 CD34 單克隆抗體標記下測定瘤體微血管密度，見生理鹽水組皮下移植瘤微血管密度明顯高于其他兩組，且血管形態(tài)紊亂，分布不勻，增生明顯。貝伐單抗組血管數(shù)量較肺積湯組少，多短粗直（見插頁圖2）。各組MVD IOD 值比較，肺積湯組及貝伐單抗組較生理鹽水組明顯降低，貝伐單抗組與肺積湯組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

圖2 各組皮下瘤CD34-MVD 表達（二步法染色×200）

表2 各組瘤組織MVD、VEGF-A 及血清VEGF-A 水平比較（±s）

表2 各組瘤組織MVD、VEGF-A 及血清VEGF-A 水平比較（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；MVD：微血管密度；VEGFA：血管內(nèi)皮生長因子-A；IOD：平均光密度；生理鹽水組：0.9%生理鹽水0.4mL/d 灌胃；肺積湯組：22.2mg·kg-1·d-1 肺積湯灌胃；貝伐單抗組：貝伐單抗15mg·kg-1 腹腔注射，1 周2 次

3.4 各組瘤組織及血清VEGF-A 表達量比較 免疫組化結果顯示，肺積湯組及貝伐單抗組皮下瘤VEGF-A 表達明顯低于生理鹽水組。半定量數(shù)據(jù)結果證實，肺積湯組及貝伐單抗組瘤組織VEGF-A 表達量明顯低于生理鹽水組（P＜0.01），但肺積湯組與貝伐單抗組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ELISA 法檢測結果顯示，肺積湯組及貝伐單抗組血清VEGF-A 水平均低于生理鹽水組（P＜0.05，P＜0.01），貝伐單抗組血清VEGF-A 水平雖低于肺積湯組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2，插頁圖3。

圖3 各組皮下瘤血管內(nèi)皮生長因子-A 表達（二步法染色×200）

4 討論

血管新生是影響腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移等惡性生物學行為的重要因素之一，腫瘤的微血管密度被認為是反應腫瘤血管生成情況的理想指標[3-4]。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子家族中最常見的一員，是已知的血管生成蛋白中作用最直接的可溶性促內(nèi)皮細胞分裂素，通過與受體結合促進血管內(nèi)皮增殖而促進腫瘤血管生成[5-6]。而貝伐單抗為最經(jīng)典的抗VEGF藥物。

宋康認為，正虛邪實是肺癌的辨證總綱，熱毒是肺癌最主要的致病邪氣，熱毒、瘀血、痰濕互結，損傷絡脈，使邪毒流注他處是肺癌形成及轉移的病理基礎，具有“濃、黏、凝、聚”的特點。治療肺癌，清熱解毒澄其源、活血化瘀通其絡、利水消腫消其瘤當根據(jù)患者的體質貫穿始終[7]。肺積湯由龍葵、蛇莓、半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草組成，具有清熱解毒、活血化瘀、利水消腫之效。君藥龍葵、蛇莓取意于治療膀胱癌方劑“龍蛇羊泉湯”。中醫(yī)認為，肺主行水，為水之上源，體內(nèi)水道上始于肺，下終于膀胱，下焦閉則上焦塞，治下亦可療上。誠如《臟腑疏鑿論》云：“肺與膀胱相通，肺病宜清利膀胱水?！鼻宕谱诤Ｔ凇吨形麽t(yī)匯通醫(yī)經(jīng)精義·臟腑通治》亦指出：“肺與膀胱相隔其遠，而實相通，肺病則水停為痰飲，故宜清利膀胱以瀉之[8]。”研究證實，“龍蛇羊泉湯”可直接抑制腫瘤生長，誘導細胞凋亡，增加小鼠機體抗氧化的能力[9]。龍葵堿已被證實可抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達[10]。蛇莓可通過抑制細胞增殖，激發(fā)細胞凋亡和失巢凋亡，抑制上皮-間質轉化和血管生成；并可改善免疫功能[11]。半枝蓮含多種活性化學成分，可通過抗炎、抑制腫瘤血管生成等過程發(fā)揮多靶點、多通路的協(xié)同抗腫瘤作用[12-13]。章尤權等[14]證實，白花蛇舌草通過調控PI3K/Akt 信號通路的相關蛋白抑制腫瘤血管新生。

本研究觀察到，以貝伐單抗作為陽性對照，荷瘤裸鼠經(jīng)肺積湯干預治療后，皮下瘤生長減慢，惡病質情況較生理鹽水組及貝伐單抗組均減輕。皮下瘤壞死、血管數(shù)量少，形態(tài)相對較規(guī)則、無癌栓形成。研究結果還顯示，肺積湯組皮下瘤組織MVD、VEGF-A表達均較生理鹽水組低（P＜0.05，P＜0.01）；與貝伐單抗組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？傊?，本研究結果證實肺積湯能抑制皮下瘤，可能與其下調組織及血清VEGF-A，維持血管穩(wěn)態(tài)，降低血管通透性，減少腫瘤血管新生，降低微血管密度，抑制腫瘤的生長和轉移有關。