結(jié)腸癌組織Nrf2 和Keap1 表達(dá)及其與增殖指數(shù)的關(guān)系

方帥帥 王 俊

結(jié)腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是臨床常見疾病。腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為高度的增殖活性[1]。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志蛋白，對失控性增殖及增殖活躍的細(xì)胞標(biāo)記效果理想[2]。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）及其接頭蛋白Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）與上皮細(xì)胞的惡變有關(guān)，對機(jī)體環(huán)境中的氧化過程及腫瘤細(xì)胞的增殖有一定的調(diào)節(jié)作用[3]。近年研究認(rèn)為Nrf2/Keap1 是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的通路之一[4]。本研究檢測CRC 組織Nrf2 和Keap1 表達(dá)，分析其與PCNA 增殖指數(shù)的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012 年1 月1 日—2013 年6月10 日期間杭州市第三人民醫(yī)院確診為結(jié)腸癌的患者96 例作為研究對象，其中男52 例，女44 例，年齡32～89 歲，平均（60.80±6.30）歲。選擇術(shù)后腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣＞3cm 的正常結(jié)腸黏膜組織作為對照組。標(biāo)本于術(shù)后立即取材，分別留取新鮮組織（-80℃冰箱凍存）和石蠟包埋組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診后行根治性手術(shù)并由病理醫(yī)師確診，依據(jù)WHO《消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型[5]；（2）具有完整的臨床及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙原發(fā)或多原發(fā)癌、林奇綜合癥的患者；（2）有消化道手術(shù)史；（3）術(shù)前有放、化療史。

1.3 方 法

1.3.1 免疫組化法 應(yīng)用免疫組化二步法檢測兩組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 表達(dá)，檢測觀察組標(biāo)本組織PCNA 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)基于石蠟包埋組織后切取的4μm切片。三種試劑均購自武漢博士德生物公司，為濃縮液，以50 為不同梯度按不同稀釋比例進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇顯色最佳的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)（Nrf2 和Keap1均為1:300，PCNA 為1:100）。正式實(shí)驗(yàn)由病理科技師操作，DAB 顯色，手工染色及顯色，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，做好質(zhì)控工作。判讀由病理醫(yī)師進(jìn)行閱片，應(yīng)用盲法，Nrf2 和Keap1 的顯色部位均是細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，PCNA 的顯色部位是細(xì)胞核，以淡黃色——棕黃色為陽性。在顯微鏡下找熱點(diǎn)區(qū)，共選擇5 個400倍視野，以二維進(jìn)行評分。著色強(qiáng)度：分別以無、弱、中、強(qiáng)計(jì)為0、1、2、3 分。陽性判定：分別以＜5%、6%～10%、11%～30%、31%～50%、＞50%為0、1、2、3、4 分。二者之和為總分（0～7 分），以≤3 分為陰性，以＞3 分為陽性。計(jì)算陽性率。

1.3.2 Western Blot 法 應(yīng)用術(shù)后留取的新鮮凍存組織，檢測兩組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 蛋白半定量表達(dá)。具體方法：GAPDH 為內(nèi)參。取樣本加裂解液后，離心，取上清液提取蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度；放入100℃水浴鍋內(nèi)煮5min，配制10%SDA-PAG凝膠，加適量蛋白和Loading Buffer 混合液，電泳，之后將Nrf2、Keap1 蛋白和GAPDH 的膠段切下轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉60min，加入20mL 抗體（Nrf2 和Keap1 均為1:1200）和20mL 一抗稀釋液，4℃過夜，次日洗膜，加入二抗，室溫1h 后洗膜，用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image J V1.47H 軟件進(jìn)行灰度分析，以蛋白與GAPDH 的比值進(jìn)行分析。

1.3.3 熒光實(shí)時定量PCR 法 應(yīng)用術(shù)后留取的新鮮凍存組織，檢測兩組新鮮組織Nrf2 和Keap1 mRNA表達(dá)。擴(kuò)增程序：95℃5min、95℃20s、67℃25s、95℃22s、60℃35s 時采集熒光。記錄Ct 值，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因和相對表達(dá)水平。ΔΔCt=[Ct 目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）]-[Ct 目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）]。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟完成具體操作，并由專業(yè)人士指導(dǎo)，做好質(zhì)控工作。引物由蘇州睿贏藥物技術(shù)有限公司合成。引物序列：GAPDH：上游5＇-GCACAGAGACACGCTACGCTTTA-3＇，下游5＇-TGGCATGAGAAAGGCATAATGCA-3＇；Nrf2：上游5＇-TTCCGGGGACTGACTCCGCTAAG-3＇，下游5＇-GCACACTGAGTTACACTGAGTTC-3＇；Keap1：上游5＇-ATGAACGCCCACTGAGTCGTAG-3＇，下游5＇-GCACGCTGATACACTTTCCCC-3＇。

表1 兩組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 蛋白陽性率比較[例（%）]

表2 觀察組不同臨床病理特征Nrf2 和Keap1 陽性率分組[例（%）]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)、t 檢驗(yàn)、Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)和KM 生存分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 陽性率比較 觀察組標(biāo)本組織Nrf2 高表達(dá)，Keap1 低表達(dá)，兩組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）。見表1、插頁圖1-4。

圖1 正常結(jié)腸黏膜組織Nrf2 陰性表達(dá)（免疫組化二步法×200）

圖2 正常結(jié)腸黏膜組織Keap1 陽性表達(dá)（免疫組化二步法×200）

圖3 結(jié)腸癌組織Nrf2 陽性表達(dá)（免疫組化二步法×200）

圖4 結(jié)腸癌組織Keap1 陰性表達(dá)（免疫組化二步法×200）

2.2 觀察組不同特征分組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1陽性率比較 觀察組標(biāo)本組織Nrf2 和Keap1 陽性率在不同腫物最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM 分期亞組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），Nrf2 和Keap 在不同性別、年齡和分化程度的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 觀察組Nrf2 和Keap1 表達(dá)與生存時間的相關(guān)性 觀察組隨訪時間6～60 個月，平均34.30 個月，經(jīng)生存分析顯示，觀察組Nrf2 和Keap1 表達(dá)與生存時間相關(guān)，即Nrf2 高表達(dá)，Keap1 低表達(dá)患者的生存時間短。見插頁圖5-6。

圖5 結(jié)腸癌組織Nrf2 表達(dá)的生存分析

圖6 結(jié)腸癌組織Keap1 表達(dá)的生存分析

2.4 觀察組Nrf2 和Keap1 表達(dá)與PCNA 增殖指數(shù)的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，Nrf2 表達(dá)和PCNA 增殖指數(shù)具有正相關(guān)性（r=0.52，P=0.011）；Keap1 表達(dá)和PCNA 增殖指數(shù)具有負(fù)相關(guān)性（r=-0.51，P=0.035）。

2.5 Wesern Blot 檢測兩組Nrf2 和Keap1 半定量表達(dá) 觀察組標(biāo)本組織Nrf2 蛋白平均半定量表達(dá)（1.01±0.13），對照組標(biāo)本組織Nrf2 蛋白平均半定量表達(dá)（0.49±0.11），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.31，P＜0.01）。觀察組標(biāo)本組織Keap1 蛋白平均半定量表達(dá)（0.59±0.15），對照組標(biāo)本組織Keap1 蛋白平均半定量表達(dá)（1.08±0.10），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.59，P＜0.01）。見插頁圖7。

圖7 Wesern Blot 檢測結(jié)腸腺癌和正常結(jié)腸黏膜Nrf2 和Keap1 半定量表達(dá)

2.6 熒光PCR 法檢測兩組Nrf2 和Keap1 mRNA 比較 觀察組標(biāo)本組織Nrf2 mRNA 平均半定量表達(dá)（1.01±0.21），對照組標(biāo)本組織Nrf2 mRNA 平均半定量表達(dá)（0.82±0.19），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組標(biāo)本組織Keap1 mRNA 平均半定量表達(dá)（0.83±0.15），對照組標(biāo)本組織Keap1 mRNA 平均半定量表達(dá)（1.20±0.25），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見插頁圖8-9。

圖8 結(jié)腸癌和正常結(jié)腸黏膜組織Nrf2 mRNA 表達(dá)

圖9 結(jié)腸癌和正常結(jié)腸黏膜組織Keap1 mRNA 表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌（CRC）與腺上皮的惡性改變有關(guān)，遺傳學(xué)是病變核心。在致癌因素的作用下引起腺上皮的異型增生，細(xì)胞的分布及形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變[5]。病變發(fā)展過程中伴隨著高度的增殖狀態(tài)，其中標(biāo)記增殖最經(jīng)典的指標(biāo)是PCNA，其表達(dá)于細(xì)胞核，能真實(shí)客觀反應(yīng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖程度[6]。研究認(rèn)為，PCNA 可以作為臨床判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，同時也是細(xì)胞去分化的重要標(biāo)志蛋白[7]。CRC 病理形態(tài)中以浸潤肌層為重要特征，因此其侵襲能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移潛能高。Nrf2 在正常機(jī)體中低表達(dá)，對防止異源性因子對DNA 的破壞有重要作用。腫瘤性因素的作用下，Nrf2 高表達(dá)，使抑制致癌物活化，加速細(xì)胞癌變。Keap1 是多區(qū)域阻遏抑制性蛋白，Nrf2 蛋白對Keap1有重要的調(diào)控作用，其可能是Nrf2 和Keap1 通路的開關(guān)因子。研究顯示，Nrf2 和Keap1 定位于細(xì)胞漿中，在泛素酶的介導(dǎo)下，使Nrf2 降解加速[8]。腫瘤細(xì)胞處于氧化狀態(tài)時，Nrf2 和Keap1 能引起Nrf2 結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 蛋白水平升高并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并與抗氧化反應(yīng)的分子相結(jié)合，激活靶基因。Nrf2 和Keap1 能形成強(qiáng)力的聚合體，可以作為Cullin結(jié)構(gòu)中依賴的E3 泛素連接酶復(fù)合物的基板，對調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移有一定作用。Keap1 的DGR 區(qū)有重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，能與Nrf2 的DLG 結(jié)構(gòu)區(qū)域相結(jié)合，對泛素酶進(jìn)行有效轉(zhuǎn)移，加速蛋白酶體的降解。此時Nrf2 由于不被降解，引起Keap1 的過度飽和，形成新的Nrf2 聚集區(qū)，并有效的調(diào)動機(jī)體的細(xì)胞保護(hù)因子。Nrf2 和Keap1 可能是內(nèi)源性抗氧化和自由基形成的因子，Nrf2 和Keap1 的表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及腫瘤性改變[9-10]。在肺癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)Nrf2 和Keap1 的異常表達(dá)，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，認(rèn)識到其不僅與生物學(xué)進(jìn)展相關(guān)，其還可能是重要的診斷因子和治療的靶點(diǎn)[11]。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織Nrf2 和Keap1 異常表達(dá)，提示Nrf2 高表達(dá)和Keap1 低表達(dá)是促進(jìn)腫瘤形成的重要的蛋白因素，Nrf2 和Keap1 蛋白表達(dá)和mRNA 表達(dá)具有明確的一致性。結(jié)腸癌組織Nrf2和Keap1 陽性率在不同腫物最大徑、浸潤深度中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二者異常表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長、局部侵襲和直接蔓延。Nrf2 和Keap1的異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示二者可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的重要因素。Nrf2 和Keap1 表達(dá)與TNM 分期有關(guān)，提示Nrf2 和Keap1 對判斷臨床分期可能有輔助意義，由于TNM 分期與腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展及判斷腫瘤的預(yù)后有關(guān)，因此Nrf2高表達(dá)和Keap1 低表達(dá)可能提示預(yù)后不良，生存分析的結(jié)果證實(shí)Nrf2 高表達(dá)、Keap1 低表達(dá)的患者預(yù)后差，與Nrf2、Keap1 與TNM 分期的關(guān)聯(lián)性結(jié)論一致。結(jié)果顯示，CRC 中Nrf2 和PCNA 具有正相關(guān)性，Keap1 和PCNA 具有負(fù)相關(guān)性，提示Nrf2 和Keap1均與PCNA 的表達(dá)具有協(xié)同作用，二者異常表達(dá)時可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞的增殖速度增加，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞生長活躍[12-13]。Nrf2 和Keap1不僅在組織分化和器官的形成中可能有一定作用，還在正常組織的成熟中有一定價值，Nrf2 和Keap1異常表達(dá)可以調(diào)控多種促癌基因的表達(dá)，激活相關(guān)癌基因，如腫瘤壞死因子、Mum-1 等[14]。Nrf2 和Keap1還能作為E2F/Rb 的靶向因子，引起腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性改變。Nrf2/Keap1 作為信號通路可以介導(dǎo)多種信號途徑，活化核因子等相關(guān)細(xì)胞分子病理通路，對腫瘤的遷移和血液供應(yīng)進(jìn)行有效調(diào)控[15]。Nrf2 和Keap1可能對TWIST 等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的因子具有一定的調(diào)控作用，這可能是腫瘤進(jìn)展中的促進(jìn)因素。近年關(guān)注Nrf2/Keap1 在腫瘤治療靶點(diǎn)及治療干預(yù)作用，后續(xù)的臨床意義可能更明顯[16-17]。

總之，Nrf2 高表達(dá)、Keap1 低表達(dá)在CRC 的形成和進(jìn)展有重要作用。Nrf2/Keap1 可能通過對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)起協(xié)同作用，術(shù)后檢測腫瘤組織Nrf2 和Keap1 表達(dá)對判斷預(yù)后具有一定價值。