李希敏 徐 露 周 璐 邵田娛 梁珍珍
腎間質(zhì)纖維化是各種致病因素引起的進(jìn)行性腎損傷的主要病理特征,也是導(dǎo)致終末期腎臟病的共同進(jìn)程,然而目前臨床尚缺乏有效的治療方法逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程。大蒜素化學(xué)名為二烯丙基三硫化物,是由大蒜經(jīng)水蒸汽蒸餾而得到的一種揮發(fā)油,也可通過(guò)人工合成。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于大蒜素對(duì)各類(lèi)腎損傷的保護(hù)作用研究[1-2]。實(shí)驗(yàn)研究證明,大蒜素對(duì)心肌、肝臟以及肺組織纖維化具有抑制作用,因此推測(cè)大蒜素對(duì)腎臟的間質(zhì)纖維化同樣具有改善效果[3-4]。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)制備大鼠腎間質(zhì)纖維化模型,觀察大蒜素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用,初步探討其作用與TGF-β1/Smads 信號(hào)通路的關(guān)系。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠18 只,清潔級(jí),體質(zhì)量(150±20)g,由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(滬)2018-0006,于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),許可證號(hào):SYXK(浙)2018-0012,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批件號(hào)ZSLL-2018-033,屏障環(huán)境,室溫20~26℃,濕度40%~70%,自由食水,7 天后用于實(shí)驗(yàn)。
1.2 藥品與試劑 大蒜素(98%,25g):上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)S25256);Masson 染色液:南京建成科技有限公司(批號(hào)D026-1-2);小鼠抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)單克隆抗體:Santa Cruz公司(批號(hào)SC65378);兔抗人磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2(p-Smad2)單克隆抗體、羊抗人磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3(p-Smad3)多克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體:杭州華安生物技術(shù)有限公司(批號(hào)ET1702-34,ET1607-43,ET1609-41);DAB 試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號(hào)ZLI-9018);HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗、兔二抗:Proteintech 公司。
1.3 主要儀器與設(shè)備 STP120 脫水機(jī)、AP280-2 包埋機(jī)、HM335E 切片機(jī):MICROM 公司;BG-270 隔水式電熱恒溫箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;蛋白電泳系統(tǒng):Bio-Rad 公司。
2.1 分組及腎間質(zhì)纖維化模型建立 18 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組與大蒜素組,每組6 只,采用UUO 建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型。大鼠禁食24h 后,行腹腔麻醉,消毒,取左側(cè)腹部切口,暴露左側(cè)腎臟,用鑷子分離出輸尿管,于中上1/3 處結(jié)扎并剪斷,致左腎完全梗阻,將腎臟置于原位后,逐層縫合大鼠腹壁。假手術(shù)組僅分離輸尿管后直接縫合。
2.2 給藥 自造模術(shù)后第1 天,大蒜素組大鼠予大蒜素60mg·kg-1·d-1灌胃處理,假手術(shù)組及模型組每天予等量生理鹽水灌胃。第14 天,將所有大鼠放入代謝籠中,收集24h 尿液,隨后將大鼠麻醉,經(jīng)心臟取血,行腎臟原位灌洗去除血液,取下左腎并稱(chēng)重,將腎臟沿長(zhǎng)軸剖開(kāi),一部分組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液,用于制備病理切片,另一部分保存于-80℃冰箱,用于蛋白質(zhì)分析。
2.3 觀察指標(biāo)
2.3.1 體質(zhì)量及腎臟指數(shù) 分別于造模后當(dāng)天稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量,第15 天稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量及左腎質(zhì)量,計(jì)算腎臟指數(shù)[腎臟指數(shù)=左腎質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%]。
2.3.2 血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及24h 尿蛋白檢測(cè) 采用尿蛋白試劑盒對(duì)尿液樣本進(jìn)行24h 尿蛋白定量測(cè)定,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清樣本的SCr 和BUN。
2.3.3 腎組織病理觀察 對(duì)部分腎組織進(jìn)行常規(guī)脫水,石蠟包埋、切片及Masson 染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎間質(zhì)的纖維化情況。
2.3.4 腎組織TGF-β1、α-SMA 檢測(cè) 運(yùn)用免疫組化法分析腎組織TGF-β1 及α-SMA 表達(dá)。方法:將石蠟切片放置60℃烤箱烘烤2h,脫蠟、水化,蒸餾水洗滌后,將切片浸入修復(fù)液,高壓熱修復(fù),加入3%H2O2溶液10min,阻斷過(guò)氧化物酶,PBS 洗滌5min,3次。加入一抗,37℃下孵育60min,PBS 洗滌后加入二抗,孵育60min,DAB 顯色1~2min,復(fù)染,透明后封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并掃描,借助Image J 圖像分析軟件,每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野(×400),計(jì)算平均光密度值(AOD)[AOD=累積光密度值(IOD)/陽(yáng)性面積(Area)],代表TGF-β1 和α-SMA 表達(dá)程度。
2.3.5 Western blot 分析 應(yīng)用Western blot 法檢測(cè)大鼠腎組織p-Smad2 和p-Smad3 表達(dá)量。方法:取-80℃留存組織剪碎后,超聲粉碎,加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液30min 提取對(duì)應(yīng)蛋白,蛋白存儲(chǔ)于-20℃冰箱。按照BCA 試劑盒步驟在96 孔板中加入試劑,酶標(biāo)儀測(cè)算蛋白含量,用去離子水和5×loading buffer 配置成蛋白總含量為5mg/mL 的樣品,100℃5min 水浴變性。在預(yù)制膠中加入每孔10μL的樣品和預(yù)染marker,電泳100V,1h,轉(zhuǎn)膜220mA,2h,封閉液封閉1.5h,敷一抗4℃搖床110rpm 過(guò)夜,洗膜10min×3 次,敷辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫?fù)u床40rpm 2h,洗膜3 次后,用ECL 顯影劑曝光。運(yùn)用Image J 軟件分析每個(gè)條帶的灰度值,與GAPDH 條帶的比值作為相對(duì)表達(dá)量。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異比較采用單因素方差(One-way ANOVA)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較 造模后當(dāng)天三組大鼠體質(zhì)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后第15 天,模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);大蒜素組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05),腎臟指數(shù)顯著低于模型組(P<0.01),與假手術(shù)組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。
3.2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較 干預(yù)結(jié)束后模型組大鼠血SCr、BUN、24h 尿蛋白均顯著高于假手術(shù)組(P 均<0.01);大蒜素組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白均低于模型組(P<0.05 或P<0.01)。見(jiàn)表2。
表1 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較(±s)
表1 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較(±s)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;大蒜素組:大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃;假手術(shù)組與模型組:等量生理鹽水灌胃
表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較(±s)
表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較(±s)
注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;SCr:血清肌酐;BUN:血尿素氮;U-TP:24h 尿蛋白;大蒜素組:大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃;假手術(shù)組與模型組:等量生理鹽水灌胃
3.3 腎臟病理觀察 使用光學(xué)顯微鏡觀察三組大鼠的Masson 染色切片,假手術(shù)組未見(jiàn)異常,模型組大鼠腎間質(zhì)明顯增寬,部分腎小管擴(kuò)張、萎縮,存在大量藍(lán)色纖維化灶,提示大鼠腎間質(zhì)纖維化模型建立成功;與模型組比較,大蒜素組大鼠腎間質(zhì)紊亂程度較輕,纖維化面積較小。見(jiàn)插頁(yè)圖1。
圖1 大鼠腎組織病理觀察(Masson 染色×200)
3.4 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)量比較 假手術(shù)組大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 蛋白免疫組化染色僅見(jiàn)少量棕色顆粒沉積,模型組棕色面明顯增大,與模型組比較,大蒜素組陽(yáng)性物質(zhì)沉積相對(duì)減少。半定量法分析顯示,模型組TGF-β1 與α-SMA 蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01),大蒜素組TGF-β1、α-SMA 量顯著低于模型組(P<0.01),但高于假手術(shù)組(P 均<0.01)。見(jiàn)表3、插頁(yè)圖2。
圖2 大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 表達(dá)(免疫組化DAB 染色×200)
表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)情況比較(±s)
表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)情況比較(±s)
注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;大蒜素組:大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃;假手術(shù)組與模型組:等量生理鹽水灌胃
3.5 各組大鼠腎組織p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達(dá)量比較 模型組大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組(P 均<0.01),與模型組比較,大蒜素組p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)量較低(P 均<0.01),但高于假手術(shù)組(P 均<0.01)。見(jiàn)表4、插頁(yè)圖3。
圖3 大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3 表達(dá)(Western Blot)
表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達(dá)量比較(±s)
表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達(dá)量比較(±s)
注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;p-Smad2:磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2;p-Smad3:磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3;大蒜素組:大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃;假手術(shù)組與模型組:等量生理鹽水灌胃
腎間質(zhì)纖維化是以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在腎間質(zhì)積聚、腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失為主要特征的病理改變,臨床上根據(jù)纖維化的進(jìn)展程度分為三期,一旦進(jìn)入纖維形成后期或瘢痕形成期,則難以通過(guò)治療逆轉(zhuǎn)。腎纖維化病理涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、腎臟固有細(xì)胞及免疫細(xì)胞的凋亡、促/抑纖維化細(xì)胞因子失衡等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究證明,多種細(xì)胞因子對(duì)該過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚,而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、骨形成蛋白(BMP-7)具有抑制作用[5]。
TGF-β1 的下游靶點(diǎn)涉及MAPKs、Smads、PKA、PKC、Ca2+等通路,以上各因子間相互調(diào)控,構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,其中Smads 蛋白作為中介分子,被認(rèn)為在TGF-β1 信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。研究表明,Smad2/3 參與ECM 合成與降解的相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控:TGF-β1 與TβRⅠ受體結(jié)合后,激活TβRⅡ受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶,使Smad2/3磷酸化,p-Smad2/3 與Smad4 形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi),促進(jìn)PAI-1 和Ⅶ膠原基因的表達(dá),進(jìn)而增加ECM 的合成并減少其降解[6-7]。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白,其含量與組織纖維化程度直接相關(guān)[8]。
大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的總稱(chēng),國(guó)內(nèi)外均有研究證明,大蒜素對(duì)不同致病因素導(dǎo)致的腎損傷具有保護(hù)作用[1-2]。另外,大蒜素能夠?qū)Σ煌K器組織的纖維化起到一定的改善作用。李少春等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí),大蒜素能夠減少心肌細(xì)胞TGF-β1 和Smad3 表達(dá),促進(jìn)Smad7 表達(dá),減輕心肌纖維化的程度;曾玉蘭[4]等研究表明,大蒜素通過(guò)下調(diào)TGF-β1和成纖維細(xì)胞α-SMA 的表達(dá),從而干預(yù)大鼠肺纖維化的發(fā)生。本研究借助UUO 制備的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型,證明大蒜素干預(yù)能夠減輕大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度,改善其腎功能,作用機(jī)制可能與降低TGF-β1 在腎組織表達(dá),抑制Smad2、Smad3 磷酸化,從而減少ECM 的生成相關(guān)。