NEDD9表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響

李豪杰 徐庭凱 王連迪

河南省漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院外二科1(462300) 心內(nèi)科2

背景：NEDD9在細(xì)胞遷移、趨化、凋亡、細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，NEDD9 siRNA可有效降低基因表達(dá)，并從不同水平上促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻斷腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。目的：探討NEDD9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)以及siRNA干擾NEDD9表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。方法：收集2017年1月—2018年1月漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院確診的結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織。常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，采用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將細(xì)胞分為對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA干擾組。采用qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中NEDD9 mRNA表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NEDD9、MMP-9、Bcl-2、Bax、TIMP1蛋白表達(dá)。結(jié)果：結(jié)腸癌組織NEDD9 mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。與對(duì)照組相比，siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制(P<0.05)，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)(P<0.05)，NEDD9、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bax、TIMP1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：NEDD9基因可通過凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax以及侵襲相關(guān)基因MMP-9和TIMP1來調(diào)控結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。

結(jié)腸癌為常見的惡性腫瘤，目前手術(shù)切除和化療是其主要的治療方法，但臨床療效并不理想，復(fù)發(fā)率較高，侵襲轉(zhuǎn)移是治療失敗和患者死亡的主要原因[1]。因此，早期準(zhǔn)確診斷和及時(shí)治療尤其重要，但由于該病起病比較隱匿，早期無癥狀，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療存在一定難度[2]。探討結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物并闡明其發(fā)生機(jī)制，對(duì)結(jié)腸癌的治療具有一定的意義[3]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)基因9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated gene 9, NEDD9)為Cas蛋白家族成員，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、趨化、凋亡、細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用[4]，與患者預(yù)后的關(guān)系密切。研究表明，NEDD9參與了乳腺癌、胃癌、大腦膠質(zhì)瘤、肺癌、胰腺癌、皮膚黑色素瘤等腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[5-7]。結(jié)腸癌中NEDD9的相關(guān)研究較少，具體的作用機(jī)制亦尚未闡明。本研究通過檢測(cè)NEDD9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，并采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中NEDD9表達(dá)，旨在探討其對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

材料與方法

一、主要材料與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2購于上海中國科學(xué)研究院細(xì)胞研究所；NEDD9 Human siRNA(OriGene公司)；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2×)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Transwell小室(美國Corning Costar公司)；兔抗人NEDD9、MMP-9、TIMP1抗體(Santa Cruz公司)；Bcl-2、Bax蛋白抗體、羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1. 組織標(biāo)本：選擇2017年1月—2018年1月漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院病理科術(shù)后診斷的16例結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織(距結(jié)腸腫瘤切緣>5 cm的正常結(jié)腸黏膜組織)，均于手術(shù)半小時(shí)內(nèi)置于液氮罐中凍存。標(biāo)本采集和使用均經(jīng)患者知情同意，研究方案由漯河市郾城區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

2. siRNA干擾序列的合成：共采用3對(duì)干擾序列。1號(hào)正義鏈：5’-UUA AGA CAG CAU UAA GCA CUG-3’，反義鏈：5’-GUG CUU AAU GCU GUC UUA ACU-3’；2號(hào)正義鏈：5’-UUU UCC UAC ACU AGU UAA GAC-3’，反義鏈：5’- CUU AAC UAG UGU AGG AAA ACG-3’；3號(hào)正義鏈：5’-UAU CAU AGA CGU CCU UUU GGU-3’，反義鏈：5’-CAA AAG GAC GUC UAU GAU AUC-3’；三條等量混合。僅含有NEDD9陰性序列的正義鏈：5’-GUA AUG ACA AUU AGA UCA CGC-3’，反義鏈：5’-UUG CGU AAU UGU GCA UCU AUC-3’。

3. 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞分為對(duì)照組(未作任何處理)、陰性對(duì)照組(僅含有NEDD9陰性序列)、siRNA干擾組(含有NEDD9基因干擾序列)。采用DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代。選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)生長至70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后，改換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4. qRT-PCR：收集結(jié)腸癌組織和細(xì)胞，以Trizol裂解并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。采用Light Cycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Roche公司)，引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。NEDD9(NM_001271033.1)上游序列：5’-CAC CGC AGT GCT TAA TGC TG-3’，下游序列：5’-GGG GGT TAT CAC CTT ATA CTT CAT-3’，產(chǎn)物大小87 bp；內(nèi)參GAPDH(NM_001289745.2)上游序列：5’-GAA GAC GGG CGG AGA GAA AC-3’，下游序列：5’-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3’，長度117 bp。采用2-△△Ct法測(cè)定NEDD9 mRNA表達(dá)。

5. 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞以1×104個(gè)/mL密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔加入CCK-8溶液 10 μL，培養(yǎng)2 h。于波長450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長曲線。

6. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長期結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后，胰酶消化，1 000×g離心5 min，收集細(xì)胞，PBS重懸計(jì)數(shù)。取5×104重懸細(xì)胞，1 000×g離心5 min，加入結(jié)合液500 μL重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，然后加入PI 5 μL，混勻，室溫孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

7. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，將密度為4×104的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基800 μL，培養(yǎng)24 h，以棉簽刮凈濾膜上層細(xì)胞，室溫甲醛固定10 min，Giemsa染色，拍照計(jì)數(shù)。

8. 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell上室膜面鋪上Matrigel。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，將密度為4×104的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞100 μL加入Transwell小室上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基800 μL，培養(yǎng)24 h，以棉簽刮凈濾膜上層細(xì)胞，室溫甲醛固定10 min，Giemsa染色，拍照計(jì)數(shù)。

9. 蛋白質(zhì)印跡法：收集轉(zhuǎn)染72 h的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，行SDS-PAGE凝膠電泳，分別加入一抗(NEDD9、MMP-9、Bcl-2、Bax、TIMP1和β-actin的工作濃度均為1∶1 000)和HRP標(biāo)記的二抗(工作濃度為 1∶1 000)，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NEDD9在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的mRNA表達(dá)

結(jié)腸癌組織中NEDD9 mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織(1.712±0.374對(duì)0.732±0.512；t=2.947，P<0.05)。

結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞中，對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達(dá)分別為1.513±0.259、1.506±0.217、0.704±0.158，三組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=117.85，P<0.05)。其中siRNA干擾組NEDD9 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(t=4.619，P<0.05)。

二、siRNA對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，siRNA干擾組不同時(shí)間點(diǎn)的A值顯著降低(P<0.05)；而對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

三、siRNA對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

圖1 siRNA對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的影響(CCK-8法)

*與對(duì)照組比較，P<0.01

與對(duì)照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

四、細(xì)胞遷移能力

與對(duì)照組相比，siRNA干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，而陰性對(duì)照組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

五、細(xì)胞侵襲能力

與對(duì)照組相比，siRNA干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，而陰性對(duì)照組與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

六、蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，siRNA干擾組NEDD9、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bax、TIMP1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。而陰性對(duì)照組上述指標(biāo)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

*與對(duì)照組比較，P<0.05

*與對(duì)照組比較，P<0.05

*與對(duì)照組比較，P<0.05

討 論

NEDD9為一種骨架蛋白，對(duì)細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲、趨化、周期以及分化具有特異性的調(diào)控作用，并與多個(gè)信號(hào)通路有聯(lián)系[8]。國內(nèi)周森君[9]發(fā)現(xiàn)，NEDD9敲減后肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，而NEDD9過表達(dá)能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞株遷移和侵襲能力。韋林等[10]的研究結(jié)果顯示，NEDD9在食管癌組織中特異性高表達(dá)，參與食管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，并與食管癌預(yù)后相關(guān)。Sima等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NEDD9可通過酪氨酸磷酸化FAK和SRC促進(jìn)宮頸癌的遷移和侵襲。本研究中，結(jié)腸癌組織NEDD9 mRNA表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD9 siRNA后，NEDD9 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，細(xì)胞增殖明顯下降，凋亡率明顯增加。提示NEDD9表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)。進(jìn)一步行蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾72 h后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增加。而Bcl-2、Bax水平及其比值對(duì)癌細(xì)胞接受凋亡信號(hào)起有關(guān)鍵作用，說明siRNA可能通過Bcl-2/Bax信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡。

已有研究表明，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的消化與腫瘤侵襲有關(guān)。腫瘤細(xì)胞分泌的MMP家族成員可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，而內(nèi)源性TIMP1為MMP的重要抑制劑。因此，MMP-9和TIMP1表達(dá)變化是癌細(xì)胞遷移和侵襲的重要原因[12-13]。已有研究[14]表明，沉默NEDD9可下調(diào)MMP-9表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲能力。本研究中，siRNA干擾NEDD9基因表達(dá)后，結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低，且MMP-9表達(dá)明顯下調(diào)，TIMP1表達(dá)明顯上調(diào)。因此，降低NEDD9基因表達(dá)可進(jìn)一步調(diào)控MMP-9和TIMP1表達(dá)，從而抑制Caco-2細(xì)胞的遷移和侵襲。

總之，沉默NEDD9基因可通過凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax以及侵襲相關(guān)基因MMP-9和TIMP1來調(diào)控結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。故抑制NEDD9基因表達(dá)有望成為結(jié)腸癌基因治療的新策略。