胃癌淋巴結轉移囊外生長與預后和SOX9表達的相關性

方瑜潔 張明麗 惠 莉

西安市第一醫(yī)院干五消化科(710002)

背景：惡性腫瘤淋巴結轉移的囊外生長模式與患者預后密切相關。目的：探討胃癌患者淋巴結轉移囊外生長對預后的影響，及其與轉錄因子SOX9表達的相關性。方法：回顧性連續(xù)收集2010年1月—2014年12月西安市第一醫(yī)院200例淋巴結轉移陽性、TNMⅠ～Ⅲ期胃癌患者，根據(jù)淋巴結轉移生長模式分為囊外生長組和囊內生長組，比較兩組臨床病理特征、總體生存期和SOX9表達情況。采用Cox比例風險模型對預后相關因素行單因素和多因素分析。結果：囊外生長組T分期T3、T4期比例、N分期N2、N3期比例、TNMⅡ～Ⅲ期比例以及SOX高表達率(94.5%對58.3%)均顯著高于囊內生長組(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示囊外生長組總體生存期顯著短于囊內生長組(P<0.05)。多因素分析表明，TNMⅡ～Ⅲ期(HR=3.224, 95% CI: 2.769～5.283, P<0.001)、淋巴結轉移囊外生長(HR=2.388, 95% CI: 1.802～3.209, P<0.001)和轉移淋巴結SOX9高表達(HR=1.321, 95% CI: 1.201～1.684, P=0.001)是影響胃癌患者總體生存期的獨立危險因素。結論：胃癌患者淋巴結轉移囊外生長與SOX9高表達相關，是預測預后不良的獨立危險因素，以及腫瘤侵襲、轉移的組織形態(tài)學標志。

胃癌是全世界第四大常見惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的第二大原因[1]。盡管近來年胃癌手術根治率不斷提高，加之化療和靶向治療的進展，使患者遠期生存率得到改善，但胃癌患者總體預后仍然不佳。淋巴結轉移是導致胃癌患者術后復發(fā)、轉移和遠期生存率降低的主要原因之一[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤淋巴結轉移灶內的腫瘤細胞有囊外生長和囊內生長兩種生長模式，并與患者預后密切相關[3]。囊外生長是指轉移至淋巴結的腫瘤細胞在淋巴結囊內增殖并突破囊壁進入周圍軟組織；囊內生長則是指腫瘤細胞僅在淋巴結囊內增殖，不突破淋巴結囊。據(jù)報道，淋巴結轉移囊外生長與結直腸癌患者的不良預后顯著相關[3]，但關注囊外生長與胃癌患者預后關系的研究報道尚少。此外，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)轉錄因子SOX9表達增強與胃癌淋巴結轉移密切相關，但其與淋巴結轉移囊外生長模式的相關性未見報道。本研究旨在探討胃癌患者淋巴結轉移囊外生長對預后的影響及其與SOX9表達的相關性。

材料與方法

一、標本來源

回顧性連續(xù)收集2010年1月—2014年12月在西安市第一醫(yī)院行胃癌根治性切除術的患者。納入標準：①行胃癌D2根治術；②TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期；③病理確診胃癌，淋巴結轉移陽性；④術前未接受新輔助化療，術后接受FOLFOX方案化療；⑤臨床病理資料和術后隨訪資料完整；⑥可獲得淋巴結轉移石蠟組織樣本或切片。排除標準：①遠處轉移；②資料不全；③淋巴結轉移樣本缺失或無法進行免疫組化分析。結果共200例患者納入研究，其中男性129例，女性71例，年齡46～84歲，平均(65.8±9.4)歲。研究方案經醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者及其家屬簽署知情同意書。

二、方法

1. 淋巴結轉移生長模式分析：轉移陽性淋巴結組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，對腫瘤細胞生長模式進行評估。分別于低倍鏡(×20)和高倍鏡(×200)視野下觀察轉移淋巴結內腫瘤細胞生長與淋巴結囊壁的位置關系。腫瘤細胞突破淋巴結囊壁延伸至淋巴結外，判斷為囊外生長(圖1A)；腫瘤細胞局限于淋巴結囊壁內，判斷為囊內生長(圖1B)。由2名對患者臨床資料和生存情況不知情的高年資病理科醫(yī)師獨立判斷，結果不符時由病理科主任醫(yī)師作最終判斷。根據(jù)轉移淋巴結生長模式將患者分為囊外生長組和囊內生長組。

2. SOX9免疫組化染色：轉移陽性淋巴結組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，脫蠟，3% H2O2室溫孵育5 min，自來水沖洗，PBS浸泡3 min，5%山羊血清室溫封閉孵育10 min；加入1∶100鼠抗人SOX9抗體(Abcam plc.)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入HRP標記羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗、復染、封片，于高倍鏡(×200)視野下評估SOX9染色強度。染色強度分為陰性(無染色)、弱(淺棕色)、中等(棕色)和強陽性(深棕色)，其中陰性和弱陽性定義為SOX9低表達，中等和強陽性定義為SOX9高表達。由2名對患者臨床資料和生存情況不知情的高年資病理科醫(yī)師獨立判斷，結果不符時由病理科主任醫(yī)師作最終判斷。

3. 術后隨訪：患者出院后接受門診隨訪，隨訪內容包括病史、體格檢查、CT或內鏡檢查，術后1年內每3個月隨訪一次，術后1年后每6個月隨訪一次。以手術日期至死亡日期為總體生存期。末次隨訪時間為2018年6月。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、囊外與囊內生長組胃癌患者臨床病理特征和預后比較

根據(jù)淋巴結轉移灶內腫瘤細胞生長模式分組，囊外生長組73例，囊內生長組127例。兩組間性別、年齡、胃癌Lauren分型和組織學分級差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在T分期和N分期中，囊

A：囊外生長模式(左圖：×20，右圖：×200)；B:囊內生長模式(左圖：×20，右圖：×200)

圖1 淋巴結轉移囊外生長和囊內生長典型HE染色結果

外生長組T3、T4期比例和N2、N3期比例均高于囊內生長組，總體TNM Ⅱ～Ⅲ期比例亦高于囊內生長組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，囊外生長組總體生存期明顯短于囊內生長組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 淋巴結轉移囊外與囊內生長胃癌患者總體生存率

二、淋巴結轉移囊外生長與SOX9表達的相關性

免疫組化染色顯示，200例胃癌患者的轉移淋巴結中，143例SOX9高表達，57例SOX9低表達(圖3)。囊外生長組SOX9高表達率明顯高于囊內生長組，差異有統(tǒng)計學意義[94.5%(69/73)對58.3%(74/127), χ2=29.897,P<0.001]。

三、胃癌患者預后相關因素分析

Cox比例風險模型單因素和多因素分析表明，TNMⅡ～Ⅲ期、淋巴結轉移囊外生長和轉移淋巴結SOX9高表達是影響胃癌患者總體生存期的獨立危險因素(表2)。

討 論

惡性腫瘤淋巴結轉移灶的囊外生長是近年腫瘤學研究的重要內容之一，研究發(fā)現(xiàn)囊外生長模式與惡性腫瘤如胃腸道腫瘤的臨床病理參數(shù)，包括TNM分期、淋巴、血管和神經侵犯、組織學分級以及腫瘤復發(fā)、預后不良等密切相關[3,6-7]。在最新版AJCC惡性腫瘤分期手冊中，囊外生長已成為頭頸部癌淋巴結分期的一項重要指標[8]。本研究結果證實胃癌淋巴結轉移囊外生長與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和總體生存期縮短呈顯著正相關，進一步的Cox比例風險模型多因素分析顯示淋巴結轉移囊外生長是胃癌患者預后不良的獨立危險因素，提示了囊外生長模式對胃癌患者遠期生存情況的預測價值。此外，上述結果亦表明囊外生長可作為胃癌更具侵襲、轉移能力的組織形態(tài)學標志。

表1 淋巴結轉移囊外與囊內生長胃癌患者臨床病理特征比較n(%)

A：SOX9低表達；B：SOX9高表達

既往研究[9]認為胃癌Lauren分型中的彌漫型與腸型相比更易發(fā)生淋巴結轉移且預后相對較差。然而本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移囊外生長組與囊內生長組間Lauren分型差異并無統(tǒng)計學意義，提示囊外生長可能更多地與腫瘤細胞自身的分子特征有關，如促癌基因表達增加等。為此，本研究檢測了淋巴結轉移灶內腫瘤細胞的SOX9表達水平。SOX9是重要的腫瘤干細胞樣標志物，同時也是腫瘤相關信號通路中重要的轉錄因子，通過調控細胞周期和細胞凋亡相關基因表達、促進腫瘤細胞增殖等，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[4-5,10-11]。在乳腺癌中，SOX9可維持腫瘤干細胞的自我更新和惡性潛能，參與誘導上皮間質轉化[11]。在包括胃癌在內的胃腸道惡性腫瘤中，其高表達與腫瘤浸潤、轉移、TNM分期以及預后不良密切相關[4-5]。本研究比較了胃癌淋巴結轉移囊外生長與囊內生長腫瘤細胞的SOX9表達，發(fā)現(xiàn)前者SOX9高表達率顯著高于后者，提示SOX9表達增強可能參與驅動具有高侵襲潛能的囊外生長模式。此外，單因素和多因素分析也證實SOX9高表達是胃癌患者預后不良的獨立危險因素。

表2 胃癌患者預后相關因素單因素和多因素分析(Cox比例風險模型)

綜上所述，本研究結果表明胃癌患者淋巴結轉移囊外生長與SOX9高表達相關，是預測預后不良的獨立危險因素，同時也是腫瘤更具侵襲、轉移能力的組織形態(tài)學標志。由此認為，在胃癌淋巴結標本的病理檢查中，不僅要注意是否存在淋巴結轉移，對于轉移陽性淋巴結還應重視觀察轉移灶內腫瘤細胞的囊外或囊內生長模式，這對于評估胃癌患者預后、制訂術后治療和隨訪方案具有重要臨床意義。