劉莉,李金麗,鄧小艷,肖慶,吳春林,胡雅君
肥胖是由于多種原因引發(fā)的體內(nèi)脂肪含量過(guò)多而產(chǎn)生的一種臨床常見(jiàn)代謝性疾病,目前肥胖癥已嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者血清中炎性因子表達(dá)水平明顯升高并可促使脂肪組織產(chǎn)生炎性反應(yīng),同時(shí)高表達(dá)的炎性因子又可參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路進(jìn)而造成胰島素抵抗[2]。育齡女性過(guò)度肥胖導(dǎo)致不孕、流產(chǎn)及妊娠并發(fā)癥發(fā)生率明顯增加,近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)女性卵泡發(fā)育、排卵等主要依賴于性激素調(diào)節(jié)系統(tǒng),而性激素主要通過(guò)脂肪組織進(jìn)行分泌及代謝[3]。由此推測(cè)過(guò)度肥胖引發(fā)的脂肪組織炎性反應(yīng)可能影響卵泡發(fā)育,深入研究可為肥胖婦女生殖治療方案的制定提供理論依據(jù)。胰島素生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor-1,IGF-1)在人體內(nèi)水平過(guò)度升高可通過(guò)促使卵泡閉鎖、凋亡進(jìn)而降低卵巢功能[4]。同時(shí)IGF-1水平升高還可通過(guò)促使胰島素受體底物表達(dá)進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路,研究發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者血清IGF-1水平升高并可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而參與多囊卵巢綜合征發(fā)生過(guò)程[5]。關(guān)于IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路與肥胖及卵泡發(fā)育的關(guān)系尚未闡明,因此,本研究通過(guò)構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型檢測(cè)卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平,初步探討其對(duì)IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響,為降低肥胖育齡女性卵泡發(fā)育異常所致的不孕不育發(fā)生率及提高輔助生殖治療效果提供一定依據(jù),報(bào)道如下。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠20只,體質(zhì)量180~270 g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,分籠喂養(yǎng)且正常飲水?dāng)z食,培養(yǎng)條件為室溫22~25℃,濕度70%。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2017-0008,動(dòng)物合格證書(shū)編號(hào)No.42000600007275,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證編號(hào)No.00133206。該實(shí)驗(yàn)于2017年1月—2018年1月在武漢市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,并獲得武漢市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.2 主要試劑與儀器 性激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、雌激素(estrogen, E2)、催乳素(prolactin,PRL)、睪酮(testosterone,T)放射免疫分析試劑均購(gòu)自天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司;白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢驗(yàn)試劑盒與三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-C,LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol,TC)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所;兔抗鼠PI3K及其磷酸化p-PI3K、Akt及其磷酸化p-Akt單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;兔抗鼠IGF-1單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司;HPR標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自普泰生物技術(shù)公司;石蠟切片機(jī)購(gòu)自湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司;G9800全自動(dòng)生化儀購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司;DMLS2光學(xué)顯微鏡購(gòu)自北京普瑞賽司儀器有限公司;SN-697B型智能放射免疫γ測(cè)量?jī)x購(gòu)自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。
1.3 建模與分組 20只雌性SD大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按照隨機(jī)數(shù)字表法選取10只作為正常飲食組,其余10只大鼠均參照張靚等[6]研究方法進(jìn)行高脂喂養(yǎng),喂養(yǎng)10周,大鼠體質(zhì)量超過(guò)正常飲食組20%視為肥胖大鼠模型建模成功[7]。將建模成功的10只大鼠作為高脂飲食組,正常飲食組與高脂飲食組SD大鼠均繼續(xù)喂養(yǎng)1周后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。
1.4 動(dòng)物麻醉及取材 2組大鼠禁食過(guò)夜,次日清晨采用1 ml利多卡因?qū)嵤└骨宦樽?,分別摘除大鼠眼球后靜脈叢取血,采集血液樣本,置于離心機(jī)內(nèi)(3 000 r/min轉(zhuǎn)速)離心20 min,收集上層血清,置于-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。取血后斷頸處死大鼠,并摘取卵巢,在無(wú)菌水中清洗3次,每組選取5只大鼠卵巢采用福爾馬林固定取出包埋于石蠟中。另選取5只大鼠卵巢剪碎后放入勻漿器,在冰盒中勻漿,并將勻漿液分裝到2.0 ml EP管中,剩余的卵巢組織凍存在-200℃的液氮中備用。
1.5 觀察指標(biāo)與方法
1.5.1 大鼠卵巢組織病理觀察: 取石蠟包埋卵巢組織,采用石蠟切片機(jī)切片,厚度約為6 μm,蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,100倍顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化,每組標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算卵泡總數(shù)、成熟卵泡總數(shù)、黃體總數(shù)等。
1.5.2 血脂水平檢測(cè):取采集的血液標(biāo)本,應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)2組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
1.5.3 卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平檢測(cè): 取采集的血液標(biāo)本,采用放射免疫法檢測(cè)血清卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平,應(yīng)用放射免疫計(jì)數(shù)器檢測(cè)大鼠血清中FSH、 E2、P、PRL、LH、T水平。
1.5.4 血清炎性因子檢測(cè): 取采集的血液標(biāo)本,采用ELISA法檢測(cè)血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
1.5.5 卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè):取20 mg卵巢組織,加入生理鹽水并研磨成組織勻漿,生理鹽水和勻漿液以10∶1混合,置于離心半徑為10 cm離心機(jī)內(nèi)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,吸取上清液,參照SOD、MDA、ACP、CAT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。
1.5.6 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)卵巢組織IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白:取100 mg大鼠卵巢組織,加入RTPA蛋白裂解液,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,取20 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,之后移至PDVF膜,5%脫脂奶粉封閉,2 h后加入IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白一抗,稀釋比均為1∶1000,4℃孵育過(guò)夜,次日加入二抗(稀釋比1∶10 000),室溫孵育1 h后采用ECL法進(jìn)行顯影,放入凝膠分析系統(tǒng)觀察各蛋白條帶并采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對(duì)各條帶進(jìn)行光密度分析,各蛋白均以β-actin為內(nèi)參基因,目的蛋白與內(nèi)參條帶積分光密度值的比值即蛋白相對(duì)表達(dá)量。
2.1 2組大鼠卵巢病理變化及卵泡、黃體變化比較 HE染色結(jié)果顯示,正常飲食組大鼠卵泡正常發(fā)育且內(nèi)含豐富的顆粒細(xì)胞,周圍含有原始卵泡與優(yōu)勢(shì)卵泡,黃體結(jié)構(gòu)正常;高脂飲食組大鼠卵泡發(fā)育不正常且內(nèi)含的顆粒細(xì)胞排列松散,同時(shí)向腔內(nèi)塌陷且無(wú)明顯卵泡腔結(jié)構(gòu),含有不良黃體且呈彌漫性篩網(wǎng)狀及微囊狀結(jié)構(gòu),同時(shí)黃素化顆粒細(xì)胞減少,圖1見(jiàn)封3。與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠發(fā)育不良卵泡比率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。高脂飲食組黃體總數(shù)17個(gè),異常10個(gè)(58.52%),正常飲食組黃體總數(shù)20個(gè),無(wú)異常黃體。
表1 2組大鼠卵泡及黃體變化比較 [例(%)]
2.2 2組大鼠體質(zhì)量及血脂水平變化比較 與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.01),見(jiàn)表2。
2.3 2組大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平比較 與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠E2、P、FSH、LH、PRL水平均顯著降低(P<0.01),T水平顯著升高(P<0.01),見(jiàn)表3。
2.4 2組SD大鼠血清炎性因子及卵巢組織中氧化應(yīng)激水平比較 與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平均顯著升高(P<0.01),卵巢組織中MDA、ACP水平均顯著升高(P<0.01),SOD、CAT水平均顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表4。
2.5 2組大鼠IGF-1/Akt通路蛋白表達(dá)比較 與正常飲食組相比,高脂飲食組大鼠IGF-1、p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),而Akt、PI3K蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖2、表5。
表2 2組大鼠體質(zhì)量及血脂水平變化
圖2 2組大鼠IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較
女性過(guò)度肥胖可引發(fā)不孕癥、月經(jīng)異常、排卵障礙及多囊卵巢綜合征等疾病,同時(shí)可增加自然流產(chǎn)及妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等風(fēng)險(xiǎn),研究顯示肥胖女性新生兒先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高[8]。肥胖患者可能通過(guò)胰島素抵抗、慢性炎性反應(yīng)等病理過(guò)程影響卵母細(xì)胞發(fā)育及妊娠結(jié)局,但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。因此,探究肥胖對(duì)卵泡發(fā)育的影響及其可能作用機(jī)制,為提高肥胖女性輔助生殖治療效果提供依據(jù)。
肥胖是指能量攝入超過(guò)能量消耗導(dǎo)致脂肪組織過(guò)
度增生,TG、TC等血脂水平升高可引起脂代謝紊亂進(jìn)而產(chǎn)生肥胖[9]。本研究通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)構(gòu)建肥胖SD大鼠模型,檢測(cè)正常飲食大鼠與肥胖大鼠血脂水平,結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常飲食組,提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖SD大鼠模型造模成功。HE染色可直接觀察卵巢病理組織改變[10]。本研究切取2組大鼠卵巢與子宮組織,HE染色觀察其病理改變,結(jié)果顯示正常飲食組大鼠卵巢原始卵泡、成熟卵泡較高脂飲食組均明顯增多,高脂飲食組卵泡發(fā)育不良且異常黃體數(shù)目較多,提示肥胖能阻礙SD大鼠生殖細(xì)胞正常發(fā)育并引發(fā)生殖功能失調(diào)。機(jī)體性激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要為下丘腦—垂體—卵巢軸(HPOA),HPOA系統(tǒng)還涉及FSH、LH、E2等激素,激素水平變化直接影響卵泡發(fā)育[11-12]。本研究結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠E2、P、PRL、FSH、LH水平均明顯低于正常飲食組,T水平明顯高于正常飲食組,說(shuō)明E2、P、PRL、FSH、LH、T水平異常可影響卵泡發(fā)育,分析原因可能為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠攝入能量過(guò)多,引起脂肪細(xì)胞堆積導(dǎo)致血液中T水平升高并抑制HPOA功能,進(jìn)而使肥胖大鼠E2、P、PRL、FSH、LH水平降低。FSH、LH、E2等相關(guān)激素異常表達(dá)可促使HPOA功能紊亂進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育停止甚至卵泡閉鎖。肥胖還是一種與炎性反應(yīng)相關(guān)的疾病,本研究進(jìn)一步分析高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖對(duì)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,結(jié)果顯示高脂飲食組大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、CRP水平均明顯高于正常飲食組,高脂飲食組大鼠卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ACP水平均明顯高于正常飲食組, SOD、CAT水平均明顯降低。有研究顯示肥胖型多囊卵巢綜合征患者血清中IL-6、TNF-α、CRP水平均明顯升高,其中IL-6作為一種前炎性細(xì)胞因子與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān),IL-6、TNF-α、CRP均與LH、FSH密切相關(guān)[13]。同時(shí)肥胖大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)還可促使卵巢組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),MDA、ACP、SOD、CAT異常表達(dá)可反映卵巢組織氧化應(yīng)激水平變化[14-16]。提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可能通過(guò)加重大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),干擾HPOA功能進(jìn)而促使FSH、LH、E2等卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平異常從而影響卵泡發(fā)育。
表3 2組大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平變化比較
表4 2組大鼠血清炎性因子及卵巢組織中氧化應(yīng)激水平比較
表5 2組大鼠IGF-1/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)比較
卵巢組織中IGF-1呈高表達(dá)時(shí),通過(guò)抑制其表達(dá)可改善HPOA調(diào)節(jié)功能進(jìn)而促使初級(jí)卵泡發(fā)育為優(yōu)勢(shì)卵泡,同時(shí)可通過(guò)提高大鼠FSH、LH、E2等激素水平抑制卵巢組織中IGF-1表達(dá)進(jìn)而恢復(fù)大鼠排卵功能[17-18]。IGF-1主要由卵巢、肝臟、脂肪組織合成分泌,研究發(fā)現(xiàn)IGF-1表達(dá)水平升高可促使雄激素過(guò)量合成進(jìn)而擾亂HPOA調(diào)節(jié)系統(tǒng)[19]。IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路可參與蛋白質(zhì)合成代謝相關(guān)過(guò)程,通過(guò)激活該信號(hào)通路可對(duì)糖尿病骨骼肌發(fā)育發(fā)揮保護(hù)作用[20-22]。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程均發(fā)揮重要作用,研究顯示多囊卵巢綜合征患者IGF-1表達(dá)水平升高可激活PI3K/Akt信號(hào)通路[23]。本研究結(jié)果顯示,高脂飲食組大鼠IGF-1、p-Akt、p-PI3K表達(dá)水平均明顯高于正常飲食組,分析原因可能為肥胖大鼠IGF-1水平過(guò)度升高可增加卵巢對(duì)黃體生成素的敏感性進(jìn)而促使卵泡閉鎖并抑制優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育,同時(shí)IGF-1可通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合并促使胰島素受體底物發(fā)生磷酸化進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路[24]。提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可能抑制優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育,其可能與IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。
綜上所述,高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可促使SD大鼠卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平紊亂進(jìn)而促使卵泡發(fā)育停止,其可能與IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路激活有關(guān)。肥胖女性生殖治療過(guò)程中抑制IGF-1水平可能有助于卵泡發(fā)育。但關(guān)于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖與卵泡發(fā)育其他信號(hào)通路及其可能作用機(jī)制均需進(jìn)一步研究。
利益沖突:無(wú)