2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠肌內(nèi)脂肪沉積和肌肉線粒體代謝的影響

段 晨，尹 聰，李 凡，張楓琳，馬澤煒，凌明發(fā)，江青艷，束 剛，王松波

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

肌內(nèi)脂肪含量是決定畜禽肉品質(zhì)的重要部分，與肉的風(fēng)味、水分含量以及嫩度息息相關(guān)。而從人類醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，骨骼肌過(guò)量的脂肪沉積會(huì)對(duì)肌肉的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)起到調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。因此，研究肌內(nèi)脂肪沉積和氧化代謝對(duì)于畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類代謝疾病的研究均具有重要意義。肌內(nèi)脂肪的含量受到品種、性別和營(yíng)養(yǎng)等多種因素的調(diào)控，其中日糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)肌內(nèi)脂肪的沉積起著重要的調(diào)控作用。共軛亞油酸自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在抗癌癥、抗肥胖和抗炎癥等各個(gè)方面都發(fā)揮了重要的作用。但是，共軛亞油酸的雙鍵在碳鏈上有多種位置排列方式，種類十分豐富，不同異構(gòu)體的生理功能不同。共軛亞油酸對(duì)于肌內(nèi)脂肪沉積具有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，共軛亞油酸可以增加豬和肉牛的肌內(nèi)脂肪含量，但試驗(yàn)中大多使用的是共軛亞油酸混合物。目前，已有近30種共軛亞油酸的異構(gòu)體被發(fā)現(xiàn)，其中順9反11共軛亞油酸（c9,t11-CLA）、反10順12共軛亞油酸（t10,c12-CLA）2種最主要的共軛亞油酸異構(gòu)體，但其對(duì)于肌內(nèi)脂肪沉積的影響機(jī)制尚不清楚。

本試驗(yàn)選取c9,t11-CLA和t10,c12-CLA異構(gòu)體對(duì)小鼠進(jìn)行飼喂，探索肌內(nèi)脂肪含量變化導(dǎo)致的線粒體代謝變化，旨在初步探索共軛亞油酸異構(gòu)體影響肌內(nèi)脂肪沉積的作用機(jī)制，為畜牧生產(chǎn)上肉品質(zhì)調(diào)控及人類醫(yī)學(xué)的胰島素抵抗提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧 3周齡SPF級(jí)C57BL/6J公鼠和維持日糧均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將成長(zhǎng)至5周齡的公鼠按體重分成3組，每組8只，分組后所有小鼠采食對(duì)照組飼料適應(yīng)1周后，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂添加2%的順9反11共軛亞油酸（c9,t11-CLA）和添加2%的反10順12共軛亞油酸（t10,c12-CLA）的日糧，試驗(yàn)期3周。共軛亞油酸異構(gòu)體（純度44%）為武漢祥和順達(dá)公司產(chǎn)品。共軛亞油酸異構(gòu)體以2%的濃度通過(guò)等能替換豆油的方式加入日糧中，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 體重、采食量、體組成 每周稱量小鼠體重、給料和剩料料重，計(jì)算采食量。飼喂3周后使用體組成儀器檢測(cè)所有小鼠體組成。

1.2.2 血清甘油三酯和游離脂肪酸 小鼠飼養(yǎng)試驗(yàn)及體組成檢測(cè)完成后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行眼球采血，采血完成后離心（3 000 r/min，15 min）得到血清，按照試劑盒（南京建成生物工程有限公司）說(shuō)明書檢測(cè)小鼠血清甘油三酯和游離脂肪酸含量。

1.2.3 肌肉采集、肌肉甘油三酯含量測(cè)定和油紅O染色血液收集完成后，打開(kāi)皮膚，暴露、分離腓腸肌和比目魚肌，左腿為分子樣，用于甘油三酯含量檢測(cè)；右腿使用硬紙片貼片固定后放入液氮，-80℃保存。切片前置于冰凍切片機(jī)平衡2 h后，使用粘附性載玻片貼片，進(jìn)行油紅O染色（染色劑貨號(hào)：O1391，Sigma-Aldrich公司），顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件進(jìn)行灰度統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 組織RNA抽提和熒光定量PCR檢測(cè) 小鼠腓腸肌的總RNA按照HiPure Total RNA Mini kit試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行抽提。抽提完成后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA樣品稀釋5倍后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。引物合成自上海生工生物工程股份有限公司，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism軟件作圖和分析結(jié)果，通過(guò)單因素方差分析的Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，＜0.05為顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠體重、采食量、體組成的影響 如圖1所示，日糧添加2種共軛亞油酸異構(gòu)體均可以降低小鼠體重和采食量（＜0.05），增加小鼠的肌肉百分比（＜0.05），降低脂肪百分比（＜0.05）。

圖1 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠體重（A）、采食量（B）、體組成（C、D）的影響

2.2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠血清甘油三酯和血清游離脂肪酸含量的影響 由圖2可見(jiàn)，2種共軛亞油酸異構(gòu)體均可降低小鼠血清甘油三酯含量（＜0.05）；日糧添加t10,c12-CLA可增加血清游離脂肪酸含量（＜0.05），而c9,t11-CLA有一定促進(jìn)作用，但達(dá)不到顯著水平（＞0.05）。

圖2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠血清甘油三酯（A）和游離脂肪酸（B）含量的影響

2.3 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌、比目魚肌甘油三酯含量以及腓腸肌肌內(nèi)脂肪含量的影響 由圖3A可見(jiàn)，t10,c12-CLA可以增加小鼠腓腸肌、比目魚肌的甘油三酯含量（＜0.05），而飼喂c9,t11-CLA與對(duì)照組無(wú)顯著差異。由于飼喂t10,c12-CLA小鼠肌肉部位甘油三酯含量升高，進(jìn)一步對(duì)小鼠腓腸肌冰凍切片進(jìn)行油紅O染色（圖3B）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，日糧添加t10,c12-CLA可以增加小鼠腓腸肌肌內(nèi)脂肪含量（＜0.05），而飼喂c9,t11-CLA與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖3C）。

圖3 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌、比目魚肌甘油三酯（A）含量以及腓腸肌肌內(nèi)脂肪含量（B、C）的影響

2.4 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響 飼喂t10,c12-CLA可降低小鼠血清甘油三酯含量，而肌肉部位甘油三酯以及肌內(nèi)脂肪含量均升高（＜0.05）。為探究這一作用是不是由于血清中的甘油三酯轉(zhuǎn)移進(jìn)入肌肉，對(duì)小鼠腓腸肌中的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。由圖4可見(jiàn)，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和4的基因表達(dá)均增加（＜0.05），提示有可能是由于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)增加導(dǎo)致血清甘油三酯減少，而肌肉部位甘油三酯和脂肪的沉積增多。

圖4 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響

2.5 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌線粒體生物合成和氧化代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 由圖5可知，日糧添加t10,c12-CLA可以增加小鼠腓腸肌線粒體生物合成和氧化代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)（＜0.05），而c9,t11-CLA則沒(méi)有這一作用。

圖5 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腓腸肌線粒體生物合成（A）和氧化代謝（B）相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠肌內(nèi)脂肪含量、線粒體生物合成和氧化代謝的影響 相關(guān)研究表明，日糧添加共軛亞油酸飼喂60 d可以導(dǎo)致牛的皮下脂肪含量顯著降低，而肌內(nèi)脂肪含量顯著升高；日糧添加共軛亞油酸也可顯著提高豬的肌內(nèi)脂肪含量。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加t10,c12-CLA可以導(dǎo)致小鼠肌內(nèi)脂肪含量的升高。這提示共軛亞油酸混合物增加肌內(nèi)脂肪可能只是t10,c12-CLA異構(gòu)體在發(fā)揮著這一作用，而且這種作用產(chǎn)生的原因是由于t10,c12-CLA導(dǎo)致肌肉部位脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)增加，促使更多的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肌肉部位，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究表明，飼喂共軛亞油酸混合物可以增加小鼠機(jī)體的基礎(chǔ)代謝，肝臟部位脂肪沉積增多，而這種肝臟脂肪的增加伴隨著胰島素抵抗現(xiàn)象，進(jìn)一步研究表明肝臟部位UCP2蛋白表達(dá)和代謝同樣顯著增加。與肝臟相同，肌肉作為能量代謝組織，脂肪同樣通過(guò)異位沉積進(jìn)入肌肉儲(chǔ)存也就變得容易接受。此外，骨骼肌增加脂肪酸攝取會(huì)導(dǎo)致過(guò)量的脂肪沉積和生物活性脂質(zhì)介質(zhì)的生成，這些介質(zhì)可能對(duì)肌肉的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)起到調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加t10,c12-CLA可以導(dǎo)致肌肉部位線粒體生物合成和氧化代謝的基因表達(dá)升高，看似與肌內(nèi)脂肪增加的表型不符，但是肌肉部位這種代謝的增加首先與機(jī)體代謝增加相吻合，其次也與骨骼肌在脂肪酸攝取增多之后產(chǎn)生的一種適應(yīng)性變化相吻合，即肌內(nèi)脂肪沉積增多，而肌肉組織試圖通過(guò)代謝來(lái)抵抗這種變化。但是最終小鼠肌內(nèi)脂肪沉積增多，可能是由于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肌肉的脂肪酸多于肌肉代謝消耗的脂肪酸，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)多的脂肪酸以肌內(nèi)脂肪的形式沉積下來(lái)。

3.2 共軛亞油酸不同異構(gòu)體發(fā)揮的作用異同以及t10,c12-CLA對(duì)肌肉作用的可能機(jī)制 在本研究中，2種共軛亞油酸異構(gòu)體均可降低小鼠體重和脂肪比例、增加小鼠肌肉比例以及血清甘油三酯含量，而僅t10,c12-CLA在肌內(nèi)脂肪沉積、線粒體生物合成和氧化代謝方面具有顯著作用。不同共軛亞油酸異構(gòu)體在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生相同或者不同的生理功能已有相關(guān)報(bào)道。如t10,c12-CLA對(duì)于肥胖小鼠減脂的影響與限飼作用相同，主要原因在于影響脂肪的周轉(zhuǎn)，而c9,t11-CLA沒(méi)有這一作用；在胰島素抵抗小鼠上，飼喂添加2種不同共軛亞油酸異構(gòu)體的日糧，同樣對(duì)小鼠的體組成產(chǎn)生了相反的作用。而在細(xì)胞上，共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)于3T3-L1脂肪前體細(xì)胞分化的作用也完全不同。在分化前期，2種異構(gòu)體都可以促進(jìn)分化，但是到了分化后期，t10,c12-CLA的作用變?yōu)橐种?，而c9,t11-CLA的作用沒(méi)有發(fā)生變化。以上研究表明，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA異構(gòu)體雖然只是1個(gè)雙鍵位置發(fā)生了變化，但可能導(dǎo)致了生理功能產(chǎn)生極大差異，這也在本研究中得到了進(jìn)一步證實(shí)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，飼喂t10,c12-CLA可以導(dǎo)致小鼠機(jī)體脂肪組織脂肪含量降低，肌內(nèi)脂肪含量增加，這是由于共軛亞油酸增加了肌肉部位脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)，進(jìn)而增加了脂肪酸向肌肉的轉(zhuǎn)運(yùn)。對(duì)于脂肪組織，t10,c12-CLA可能通過(guò)促進(jìn)代謝和脂肪分解等過(guò)程來(lái)降低脂肪沉積。但肌肉部位脂肪形成受到一些旁分泌因子的調(diào)控作用，如在運(yùn)動(dòng)之后褐色脂肪會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)因子12,13-diHOME，進(jìn)而促進(jìn)肌肉組織脂肪酸攝取；支鏈氨基酸代謝產(chǎn)物3-HIB可以通過(guò)促進(jìn)肌肉部位內(nèi)皮細(xì)胞的脂肪酸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)肌內(nèi)脂肪沉積。t10,c12-CLA導(dǎo)致不同部位脂肪沉積出現(xiàn)差異，降低皮下脂肪含量，而增加肌內(nèi)脂肪含量，這種來(lái)源于肌肉內(nèi)的旁分泌中間代謝產(chǎn)物對(duì)于跨膜脂肪酸的調(diào)配作用可為后續(xù)研究提供一個(gè)合理的方向。至于t10,c12-CLA是否是通過(guò)促進(jìn)某種具備調(diào)控作用的旁分泌因子生成而導(dǎo)致了肌肉部位脂肪沉積的增多，需要更進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，與c9,t11-CLA相比，t10,c12-CLA在肌內(nèi)脂肪沉積、肌肉部位線粒體生物合成和氧化代謝方面發(fā)揮著更顯著的作用。