樟樹籽仁油對非酒精性脂肪肝病小鼠肝脂及肝功能的研究

羅松 甘陽 蔡英傲 馬浩鑫 朱桂達(dá) 王報(bào)貴

摘 ?要：目的 觀察樟樹籽仁油對非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型小鼠肝脂及肝功能的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法10 只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常組2只和肝脂變模型組8只，模型組小鼠給予MCD飼料喂養(yǎng)6w成功構(gòu)建NAFLD模型，將模型小鼠分為 4 組：自然恢復(fù)組、樟樹籽仁油組、豬油組、大豆油組，分別灌胃磷酸鹽緩沖液、樟樹籽仁油、豬油、大豆油，200 μL/只，周期4w，實(shí)驗(yàn)全程均自由攝食基礎(chǔ)飼料和水。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠行動(dòng)遲緩，活動(dòng)量減少，體重降低，糞便具有明顯的油膩感，并且肝臟均呈現(xiàn)淡黃色;與模型組比較，樟樹籽仁油組肝臟甘油三酯、膽固醇含量均顯著降低。肝臟指數(shù)及組織病理學(xué)分析顯示樟樹籽仁油可以抑制肝臟脂肪沉積。結(jié)論 樟樹籽仁油能夠有效降低NAFLD小鼠肝脂水平，有利于肝功能的恢復(fù)，具有保護(hù)肝臟的作用，為該疾病的患者提供了一種膳食用油參考。

關(guān)鍵詞：樟樹籽仁油;非酒精性脂肪肝病;肝脂;肝功能

引 言

樟樹作為我國特產(chǎn)珍貴經(jīng)濟(jì)林樹種[1]，不僅具有較好的綠化價(jià)值，而且含有豐富的天然樟腦和芳香油等藥用物質(zhì)，具有極高的藥用價(jià)值，但是并未對果實(shí)中所含的油脂進(jìn)行開發(fā)和合理的利用，使物不能盡其用，造成資源浪費(fèi)。早期研究發(fā)現(xiàn)樟樹籽中含油率高達(dá) 40%以上，所含脂肪酸種類主要有：辛酸、癸酸、月桂酸等[2]。隨著研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)與一般植物油不同的是，樟樹籽仁油中癸酸（C10）和月桂酸（C12）含量相對較高，約占90%以上，屬于天然中碳鏈油脂資源，所以可利用樟樹籽仁油合成功能性油脂——中碳鏈甘油三酯及其衍生物[3-5]。國內(nèi)外相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，飲食中添加中碳鏈甘油三酯 可以增加熱能，減少脂肪沉積[6]。中碳鏈甘油三酯既具有給食品提供能量和營養(yǎng)的作用，又不影響食品風(fēng)味[7]，并且具有奇特的代謝方式和特定的保健作用，因此近年來備受青睞。其奇特的代謝方式是因?yàn)橹刑兼湼视腿ソ?jīng)機(jī)體分解后成為中鏈脂肪酸[8]，因?yàn)樘兼溳^短并且不依賴于肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸，所以氧化迅速且不易在脂肪組織和肝臟組織中蓄積，因其代謝速率快于長碳鏈甘油三酯，不易再合成甘油三酯，所以不易在肝臟中沉積，對肝臟代謝的壓力減輕[9]。中碳鏈甘油三酯作為食品中天然存在的成分，中鏈脂肪酸在脂質(zhì)代謝方面的優(yōu)勢使其成為最近研究的焦點(diǎn)。

以肝細(xì)胞脂質(zhì)過多為特點(diǎn)的連續(xù)性疾病NAFLD，不僅是我國第一大慢性肝病和健康查體肝酶異常的主要原因，也是西方國家肝功能異常和慢性肝病最主要的原因[10]。NAFLD病因?qū)W的機(jī)制包括增加大量游離脂肪酸，降低游離脂肪酸的β-氧化，增加脂質(zhì)過氧化等作用。飲食因素可影響NAFLD等各類肝臟疾病的脂肪滲透和脂質(zhì)過氧化，而對于NAFLD的飲食治療方法[11]強(qiáng)調(diào)嚴(yán)格控制熱量攝入，控制飲食中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的攝入量。研究發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸的過量攝入可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷、肝脂肪變和炎癥。不適當(dāng)?shù)纳攀持緮z入、過量的軟飲料攝入、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激的增加導(dǎo)致游離脂肪酸向肝臟的輸送增加和肝甘油三酯的積累增加。

NAFLD患者通常有飲食不規(guī)律的不良習(xí)慣，并且狂熱追求高熱、高脂、口味重的飲食，因而導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)過度積聚，加速NAFLD的形成及惡化。中碳鏈甘油三酯不易在肝臟中沉積，可減輕肝臟代謝的壓力，并且中碳鏈甘油三酯是一種安全無毒物質(zhì)，有顯著減輕體重的作用，其代謝途徑獨(dú)特、供能快速。本實(shí)驗(yàn)采用NAFLD模型的建立、甘油三酯定量測定法、總膽固醇定量測定法以及蘇木精-伊紅染色法。探索是否通過攝入一定量的樟樹籽仁油可以改善脂質(zhì)在NAFLD小鼠肝臟內(nèi)的聚集，改善肝功能，從而在不影響油脂攝入量和改善食品風(fēng)味的前提下，探索出新型油脂，積極并且有效糾正機(jī)體的能量失衡。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料

健康 C57BL/6J小鼠 10只，雄性，體質(zhì)量 12～25 g，動(dòng)物許可證號：SYXK（魯）2016 0008，飼養(yǎng)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。MCD模型飼料（基于AIN93G標(biāo)準(zhǔn)，10%玉米油、高糖）南通特洛菲飼料有限公司加工制作。符合實(shí)驗(yàn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)?；窘M成：玉米、小麥、大豆油、十分、魚粉、磷酸氫鈣、維生素、礦物質(zhì)等，營養(yǎng)成分保證值（%）：水分≤100，粗蛋白≥220，粗脂肪≥40，粗纖維≤50，粗灰分≤80，鈣：10-18，磷：6-12，賴氨酸≥13.2，蛋氨酸±7.8 及胱氨酸≥7.8。濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司加工制作。

1.2 主要試劑與儀器

樟樹籽仁油為南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，大豆油、豬油、無水乙醇、TG和TC試劑盒（南京建成生物工程研究所）、HBS-1096A酶標(biāo)儀、電子天平、SPX-250生化培養(yǎng)箱、TD5A臺式低速離心機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1技術(shù)路線

2.2建立非酒精性脂肪肝病模型組

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再根據(jù)體重隨機(jī)分為 2 組。即：對照組（n=2）、非酒精性脂肪肝病模型組（n=8）。對照組，全程喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。NAFLD模型組喂食MCD模型飼料，喂食6周后，通過肝臟HE染色、油紅O染色和TG、TC含量檢測等確定肝脂變模型的建立。構(gòu)建成功的NAFLD模型小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為4組，即樟樹籽仁油組、豬油組、大豆油組及自然恢復(fù)組，每組各 2 只，分別灌胃樟樹籽仁油、豬油、大豆油，自然恢復(fù)組及對照組灌胃磷酸鹽緩沖溶液，灌胃容量初期為100uL/只，小鼠適應(yīng)灌胃過程一周后，灌胃劑量增加至200uL/只。實(shí)驗(yàn)周期為4w，期間小鼠自由攝食、飲水，需要定期觀察并測定相應(yīng)指標(biāo)。

2.3內(nèi)臟器官采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束小鼠眼球取血后，頸椎脫臼處死，再使用75%的酒精棉球?qū)π∈蟾共科つw消毒，用鑷子將小鼠的腹部的皮膚挑起，隨后用手術(shù)剪將腹腔和胸腔剪開，仔細(xì)觀察小鼠各內(nèi)臟器官，小心分離，用生理鹽水洗凈，用天平稱重，最后放入-20℃冰箱待用。

2.4臟器指數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，迅速分離腹部脂肪、肝臟，用濾紙將組織液吸干后，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。計(jì)算公式：臟器指數(shù)（%）=臟器濕重/體重 × 100%。

2.5 肝脂檢測

各組分別取肝臟右葉重約0.5 g，按重量（g）：體積（ml）= 1：9 的比例，加入勻漿介質(zhì)中，冰水浴條件下勻漿，2500 r/min，離心10分鐘，取部分上清液依次稀釋，采用酶標(biāo)儀分別檢測肝臟原液，2倍稀釋液，4倍稀釋液，測定TG、TC含量。

2.5.1甘油三酯的測定

甘油三酯在脂肪酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和過氧化酶的作用下生成的醌類化合物顏色的深淺與甘油三酯的含量成正比（GPO-PAP 法），分別測定標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光度值，可計(jì)算樣品中甘油三酯的含量。

取96孔板按試劑盒操作表加樣，充分混勻，于37℃生化培養(yǎng)箱中孵育 10 分鐘，設(shè)定酶標(biāo)儀波長為 492 nm，測定各管吸光度值。根據(jù)校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TG的含量。

2.5.2膽固醇的測定

膽固醇酯在膽固醇酯酶、氧化酶和過氧化酶的催化作用下生成紅色醌化物。操作步驟同2.5.1，再根據(jù)校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TC的含量。

2.6組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)

選取固定液為10%福爾馬林溶液，取部分肝臟，稱重并浸入配好的固定液中。固定好的肝臟經(jīng)一系列操作后HE染色，用于組織病理學(xué)觀察。

3.結(jié)果與討論

3.1 動(dòng)物一般情況

在實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠精神狀態(tài)穩(wěn)定，飲水?dāng)z食均正常，并未出現(xiàn)任何異常表現(xiàn)及死亡現(xiàn)象。NAFLD模型構(gòu)建成功后，小鼠行動(dòng)緩慢，活動(dòng)量減少，體重減輕，與空白組相比，糞便不成型具有較明顯的油膩感。

3.2 樟樹籽仁油對NAFLD小鼠肝臟指數(shù)的影響

動(dòng)物染毒后，受損臟器重量將會發(fā)生改變，因而臟器系數(shù)也相應(yīng)而改變。根據(jù)表3.2臟器指數(shù)，對比空白組與樟樹籽仁油，觀察發(fā)現(xiàn)，兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相近，臟器與體重的比值比較恒定，樟樹籽仁油組臟器受損程度較小，對比空白組發(fā)現(xiàn)，豬油組、大豆油組肝臟指數(shù)減小，表示肝臟出現(xiàn)萎縮及其他退行性改變，其中豬油組肝臟受損程度最大;自然恢復(fù)組肝臟指數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等。

3.3 樟樹籽仁油對NAFLD小鼠肝臟中TG含量的影響

肝臟是內(nèi)源性血脂和脂蛋白合成及代謝的重要場所，與脂代謝密切相關(guān)。通過脂代謝進(jìn)入肝臟的脂肪被不斷合成TG并以脂蛋白形式進(jìn)入血循環(huán)，形成動(dòng)態(tài)平衡。肝內(nèi)合成及運(yùn)轉(zhuǎn)平衡一旦失衡則會導(dǎo)致TG在肝內(nèi)堆積而形成非酒精性脂肪肝。由表3.3可知，樟樹籽仁油組小鼠肝臟中TG濃度與正常對照組無顯著性差異，而豬油、大豆油組及自然恢復(fù)組小鼠肝臟中TG濃度則顯著高于對照組和樟樹籽仁油組。

3.4 樟樹籽仁油對NAFLD小鼠肝臟中TC含量的影響

由表3.4可知，樟樹籽仁油組小鼠肝臟中TC濃度與正常對照組無顯著性差異，而豬油、大豆油組及自然恢復(fù)組小鼠肝臟中TC濃度則顯著高于正常對照組和樟樹籽仁油組。

3.5 組織病理學(xué)分析

自然恢復(fù)組、大豆油組、豬油組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顯現(xiàn)出大小不等、圓形、有張力的脂滴空泡，其中豬油組尤為嚴(yán)重，肝細(xì)胞脂變，肝臟組織受到不同程度的損傷。而樟樹籽仁油組肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)類似于正常對照組，結(jié)構(gòu)完整，無變性壞死。

結(jié)論：

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)MCD飼料誘導(dǎo)后，NAFLD模型組小鼠行動(dòng)緩慢，活動(dòng)量減少，體重較輕，糞便具有明顯的油膩感，且肝臟均呈淡黃色，表明高脂飼料對肝臟造成一定損傷，NAFLD造模成功。實(shí)驗(yàn)中樟樹籽仁油組小鼠肝臟受損程度較小。與豬油、大豆油相比，樟樹籽仁油能夠顯著降低NAFLD 小鼠肝臟中TG、TC濃度。組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明樟樹籽仁油是一種無毒、健康的油脂，能夠有效降低NAFLD小鼠肝脂水平，有利于肝功能的恢復(fù)，具有保護(hù)肝臟的作用，為該疾病的患者提供了一種膳食用油參考。

參考文獻(xiàn)

[1] ?肖復(fù)明，江香梅，熊彩云，等. 樟樹種子油中脂肪酸成分分析[J]. 江西林業(yè)科技，2008（01）：60-61.

[2] ?中國油脂植物編寫委員會. 中國油脂植物[Z]. 北京：科學(xué)出版社，1987.

[3] ?Zhao M L，Yang H，Yang F，et al. composition analysis of Cinnamomum camphor seedkernel oil and shell oil[J]. Journal of Nanchang University（Natural Science），2012，36（05）：445-448.

[4] ?曾哲靈，王林林，鄭菲，等. 樟樹籽仁油合成癸/月桂?；劝彼徕c工藝研究[J]. 中國油脂，2013（02）：69-72.

[5] ?陳緒軍，曾哲靈，高文帥，等. 單癸酸甘油酯的制備及理化性質(zhì)[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（理科版），2015（02）：168-174.

[6] ?Bray G A，Lee M，Bray T L. Weight gain of rats fed medium-chain triglycerides is lessthan rats fed long-chain triglycerides.[J]. International journal of obesity，1979，4（1）：27-32.

[7] ?王報(bào)貴. 中碳鏈脂肪酸改善脂變肝細(xì)胞損傷和脂代謝紊亂的機(jī)制[D].南昌大學(xué)，2017.

[8] ?Hashim S A，Tantibhedyangkul P. Medium chain triglyceride in early life：effects on growth of adipose tissue[J]. Lipids，1987，22（6）：429-434.

[9] ?Ooyama K，Kojima K，Aoyama T，et al. Decrease of food intake in rats after ingestion of medium-chain triacylglycerol.[J]. J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），2009，55（5）：423-427.

[10] ?馮瑞兵 .胰島素抵抗與非酒精性脂肪性肝病 [J].臨床誤診誤治，2013，26（11）：100-103.

[11] ?常彬霞，鄒正升，李保森，等. 2015 年日本胃腸病學(xué)會非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎循證醫(yī)學(xué)治療指南[J].臨床肝膽病雜志 2015，31（7）：1027 -1030.

作者簡介：羅松，男，濱州學(xué)院本科在校生，生物制藥專業(yè)，主持山東省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目。

通訊聯(lián)系人：王報(bào)貴，博士。

基金項(xiàng)目：濱州學(xué)院博士科研啟動(dòng)費(fèi)（2018Y18）;山東省創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S201910449037）。