淺析秀麗隱桿線蟲被大量用于篩選抗衰老藥物的原因和相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟

彭宇昀

摘要：秀麗隱桿線蟲是研究老化現(xiàn)象的重要模型生物，已經(jīng)使用了近40年，在對(duì)具有延緩衰老作用的相關(guān)藥物進(jìn)行初步篩選方面具有重大貢獻(xiàn)。本文通過對(duì)有關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，就秀麗隱桿線蟲被大量應(yīng)用于篩選抗衰老化合物的原因和有關(guān)實(shí)驗(yàn)展開研究，分析利用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行抗衰老藥物篩選的優(yōu)點(diǎn)，總結(jié)相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟，得出秀麗隱桿線蟲細(xì)胞數(shù)目固定，與人類基因同源性較高且易養(yǎng)殖是其用于進(jìn)行藥物篩選的重要原因。總結(jié)出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)需要充分考慮，排除如待測的相關(guān)藥物對(duì)OP50菌液的抑制性等無關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲，抗衰老，篩選，原因

秀麗隱桿線蟲作為模式生物在生命科學(xué)的各項(xiàng)研究中使用廣泛，大量運(yùn)用于抗衰老藥物的篩選。[1]

近年來，有研究提出諸如阿司匹林，二甲雙胍等常用藥物成分具有延緩人體衰老的功能，而秀麗隱桿線蟲在對(duì)這類化合物的篩選過程中起了重要作用。本文將探究秀麗隱桿線蟲被廣泛應(yīng)用于抗衰老化合物篩選的原因。

1 原因分析

1.1自身原因

1.1.1 細(xì)胞數(shù)量固定

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲在其幼蟲時(shí)期有556個(gè)體細(xì)胞和2個(gè)原始生殖細(xì)胞。秀麗隱桿線蟲的成蟲可分為：雄性個(gè)體和雌雄同體個(gè)體兩類，其中雄性成熟個(gè)體有1031個(gè)體細(xì)胞和1000個(gè)生殖細(xì)胞，雌雄同體成熟個(gè)體含有959個(gè)體細(xì)胞和2000個(gè)生殖細(xì)胞。固定的細(xì)胞數(shù)量使研究人員可以更容易對(duì)比不同化合物的作用下，同種細(xì)胞在不同個(gè)體中在藥物作用下的具體變化，減少無關(guān)變量的產(chǎn)生，使不同個(gè)體（如：用抗衰老藥物處理和不用抗衰老藥物處理的個(gè)體）的同種細(xì)胞之間差異性的比較更具有說服力。同時(shí)，可以更好的探究藥物在具體細(xì)胞中的作用方式、具體效果，探究對(duì)應(yīng)化合物具有抗衰老作用的原因。

1.1.2 生殖能力強(qiáng)，雌雄同體

相關(guān)文獻(xiàn)表明，當(dāng)秀麗隱桿線蟲的雌雄同體成熟個(gè)體自體受精時(shí)可產(chǎn)生200～300顆卵，而雄性成熟個(gè)體與雌雄同體成熟個(gè)體交配，發(fā)生異體受精時(shí)可以產(chǎn)生1000多顆卵。同時(shí)，受精過的卵孵化速度快，時(shí)間短，在25℃的條件下只需大約20個(gè)小時(shí)就可以孵化成L1期的幼蟲，秀麗隱桿線蟲的受精卵從發(fā)育到性成熟只需3天的時(shí)間。強(qiáng)大的生殖能力和其雌雄同體的特性保證了實(shí)驗(yàn)材料的充足，和另兩種模式生物：果蠅（Drosophila melanogaster）與小鼠相同。，強(qiáng)大的生殖能力是他們能被選作模式生物的重要原因之一，因而現(xiàn)在被廣泛的用于各種科學(xué)研究。

1.1.3 屬于自由生活線蟲，對(duì)人體、環(huán)境無毒害作用

秀麗隱桿線蟲與大多數(shù)的線蟲不同，它是自由生活種類線蟲，不需要寄生在動(dòng)植物中生存。土壤中就有秀麗隱桿線蟲的存在，其對(duì)環(huán)境沒有毒害作用。同時(shí)，作為模式生物，秀麗隱桿線蟲已被證實(shí)對(duì)人體無害，因而可以在實(shí)驗(yàn)室大量培養(yǎng)，用于各種實(shí)驗(yàn)。

1.1.4 個(gè)體微小，通體透明，易觀察

秀麗隱桿線蟲成蟲長約1.5mm，通體透明，可用體式顯微鏡直接進(jìn)行觀察。通體透明使雌雄同體成蟲體內(nèi)的卵可被直接觀察到，為區(qū)分成蟲提供了有利條件，跟容易進(jìn)行同步化。易于觀察的特點(diǎn)使研究人員可以更容易的判斷其運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)弱，咽泵運(yùn)動(dòng)是否存在，同時(shí)也可以通過多次觸碰的方式來判斷秀麗隱桿線蟲是否死亡，對(duì)后續(xù)最長壽命、半數(shù)致死天數(shù)的統(tǒng)計(jì)和分析提供了有利條件

1.1.5 生命周期短

在20℃的條件下，秀麗隱桿線蟲在實(shí)驗(yàn)室中的生命周期一般為2～3周，發(fā)育期只有幾天。較短的生命周期使篩選具有抗衰老作用的化合物的實(shí)驗(yàn)周期大幅縮短，篩選效率大幅提升。1.1.7基因特點(diǎn)

秀麗隱桿線蟲的所有基因組已經(jīng)完成了測序，其所有基因組可以直接在網(wǎng)絡(luò)上查到，而且其藥靶基因中有60%～80%與人類基因同源。而在孟德爾人類遺傳資料庫的人類疾病基因中，秀麗隱桿線蟲也有20%以上與人類同源。在抗衰老化合物的篩選過程中，由于待測化合物數(shù)量多不同模式生物進(jìn)行相關(guān)測試所需的時(shí)間和物質(zhì)成本相差較大，一般來說與人同源性越高的模式生物進(jìn)行抗衰老實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間和物質(zhì)成本也就越高。所以篩選過程按與人類基因同源性由小到大，所用時(shí)間和物質(zhì)成本由低到高進(jìn)行分層篩選，一般按照酵母菌，秀麗隱桿線蟲，果蠅，小鼠的順序進(jìn)行篩選。由于其藥靶基因與人類的同源性較高，進(jìn)行抗衰老藥物篩選具有一定的參考價(jià)值，Petrascheck就用秀麗隱桿線蟲篩選了8.8萬個(gè)化合物，并發(fā)現(xiàn)其中有115個(gè)可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命，其較強(qiáng)的篩選能力也是其被廣泛使用的原因之一。[2]

1.2外圍因素

1.2.1 易養(yǎng)殖

秀麗隱桿線蟲以細(xì)菌為食，可以用另一種模式生物大腸桿菌在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。一般實(shí)驗(yàn)室用OP50—NGM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，尿嘧啶缺陷型大腸桿菌只能從NGM中獲取尿嘧啶才可以生長，所以其生長速度遠(yuǎn)低于一般大腸桿菌，它既可以為秀麗隱桿線蟲提供充足的食物，又不會(huì)因?yàn)樯L過快而制約秀麗隱桿線蟲的生長。而對(duì)應(yīng)的尿嘧啶缺陷型大腸桿菌只需利用L Broth液體培養(yǎng)基培養(yǎng)就可大量制得，培養(yǎng)方法的簡單和秀麗隱桿線蟲強(qiáng)大的繁殖能力，為篩選化合物所需的大量線蟲提供了供應(yīng)保障。

1.2.2 同步化過程簡單，得到的同步化線蟲數(shù)量多

同步化的線蟲可以直觀的通過對(duì)比，比較出藥物對(duì)其壽命的影響。同步化秀麗隱桿線蟲的方法并不復(fù)雜，用健康成蟲、M9緩沖液、線蟲裂解液（次氯酸鈉和氫氧化鈉混合溶液），經(jīng)洗脫、裂解、離心等步驟后，即可得到大量同步化蟲卵。區(qū)分成蟲時(shí)只需利用顯微鏡對(duì)蟲體進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)蟲體中有卵即為雌雄同體秀麗隱桿線蟲成蟲

2 相關(guān)試驗(yàn)方法

根據(jù)大量有關(guān)文獻(xiàn)和對(duì)上述原因分析，總結(jié)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法。

2.1 培養(yǎng)方式

秀麗隱桿線蟲可以用固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)需要制備大腸桿菌OP50相關(guān)溶液、M9緩沖液和消化液。[3]

固體培養(yǎng)基需用NGM培養(yǎng)基和1M磷酸緩沖液，液體培養(yǎng)基需S medium、S 培養(yǎng)原液、1M 檸檬酸鉀和相關(guān)金屬溶液。

2.2 檢測藥物對(duì)OP50菌液的影響

由于秀麗隱桿線蟲需要以大腸桿菌為食，若被檢測的相關(guān)藥物具有抗菌作用，則需要在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行檢測，以防止相關(guān)藥物減少秀麗隱桿線蟲的攝食量，導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）進(jìn)入持久期，發(fā)揮秀麗隱桿線蟲自身的抗衰老作用。

檢測藥物對(duì)OP50菌液的影響可通過設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，檢測加入了相關(guān)藥物后OP50培養(yǎng)基的OD值和不加入相關(guān)藥物的對(duì)照組OP50培養(yǎng)基的OD值并進(jìn)行比較。若在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期中OD值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，則相關(guān)藥物對(duì)OP50生長無顯著影響。

2.3 檢測秀麗隱桿線蟲對(duì)相關(guān)藥物是否有飲食偏好

對(duì)于像大多數(shù)中藥一樣具有特殊氣味的藥物，需要先分析相關(guān)藥物的特殊氣味是否會(huì)對(duì)秀麗隱桿線蟲的飲食偏好有所影響。

判斷秀麗隱桿線蟲對(duì)相關(guān)藥物是否有飲食偏好可通過設(shè)置吸引實(shí)驗(yàn)，檢測并統(tǒng)計(jì)含有相關(guān)藥物的菌斑和對(duì)照組不含相關(guān)藥物的菌斑吸引的秀麗隱桿線蟲的數(shù)目有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異來得出有關(guān)結(jié)論。

2.4 抗衰老相關(guān)指標(biāo)檢測

秀麗隱桿線蟲的生命周期可分為四個(gè)階段，生殖期、壯年期、衰老期和老年期。上述四個(gè)時(shí)期可分別通過檢測秀麗隱桿線蟲的自體受精、快速身體運(yùn)動(dòng)、咽部運(yùn)動(dòng)的結(jié)束和死亡四個(gè)階段進(jìn)行區(qū)分。

2.4.1 自體受精

觀測自體受精可以每天將秀麗隱桿線蟲幼蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)移，每次轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基中并觀測培養(yǎng)基中是否有新的幼蟲出現(xiàn)，直至不再出現(xiàn)新的幼蟲，屆時(shí)可判斷秀麗隱桿線蟲已進(jìn)入壯年期。

每天將秀麗隱桿線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)移既是為了檢測其是否處在生殖期，又是防止其與其子代幼蟲被混淆的關(guān)鍵措施，必須要及時(shí)進(jìn)行。

2.4.2 身體運(yùn)動(dòng)

觀測秀麗隱桿線蟲的身體運(yùn)動(dòng)可通過敲擊培養(yǎng)皿，觀察秀麗隱桿線蟲在10sec內(nèi)頭部運(yùn)動(dòng)距離是否大于1mm，若大于則秀麗隱桿線蟲處在快速運(yùn)動(dòng)期；若小于則處在非快速運(yùn)動(dòng)期。

2.4.3 咽部運(yùn)動(dòng)

觀測咽部運(yùn)動(dòng)時(shí)，需在顯微鏡下記錄10sec內(nèi)秀麗隱桿線蟲咽部的收縮次數(shù)，多次測量取平均值。收縮次數(shù)在1～24次為緩慢收縮，大于等于24次為快速收縮，0次為不收縮。

2.5 細(xì)化實(shí)驗(yàn)，探究相關(guān)藥物對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用所處階段

在檢測出相關(guān)藥物對(duì)秀麗隱桿線蟲具有抗衰老作用后，可進(jìn)一步細(xì)化實(shí)驗(yàn)以探究相關(guān)藥物的具體作用時(shí)期。由于秀麗隱桿線蟲的生命周期分為四個(gè)階段，細(xì)化實(shí)驗(yàn)時(shí)可通過上文敘述的判斷方法區(qū)分秀麗隱桿線蟲所處的階段，具體統(tǒng)計(jì)每一階段所處的天數(shù)并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。

3結(jié)論

1、由上述文章分析可知，秀麗隱桿線蟲廣泛用于藥物篩查的原因主要是秀麗隱桿線蟲固定的細(xì)胞數(shù)目，基因與人類同源性較高且易養(yǎng)殖。

固定的細(xì)胞數(shù)目有助于減少無關(guān)變量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說服力；由于基因與人類同源性越高的動(dòng)物往往越難養(yǎng)殖，所以秀麗隱桿線蟲與人類在基因上較高的同源性和其易養(yǎng)殖的特點(diǎn)讓其被廣泛運(yùn)用于抗衰老藥物的初步篩查。

2、實(shí)驗(yàn)時(shí)需充分考慮被篩選藥物在無關(guān)變量方面對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

實(shí)驗(yàn)中除了要減少常規(guī)物理因素帶來的無關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響之外，還要注意藥物是否會(huì)對(duì)培養(yǎng)基，秀麗隱桿線蟲的進(jìn)食行為產(chǎn)生非藥理性影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊再昌，楊小生.秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）在藥物篩選中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2009，21（04）：593-598.

[2]Petrascheck M，Ye XL，Buck LB. An antidepressant thatextends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature，2007，450（11）：553-6

[3]劉靜. 黃芪多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲的延壽作用及其機(jī)制研究[D]. 哈爾濱醫(yī)藥大學(xué)，2013.