益生菌研究進展及其在寵物食品加工中的應(yīng)用現(xiàn)狀

■ 張賽賽

（上海寵濟生物科技有限公司，上海 200082）

伴侶動物已成為社會中非常重要的成員，如犬在過去兩個世紀(jì)里的社會角色已經(jīng)從主要勞力（即監(jiān)護、運輸、放牧和狩獵）演變?yōu)槟軌騽偃伟ㄌ厥庑袆樱ㄈ缇仍?、軍事）、治療護理（如疾病檢測、幫助感官受損者）和陪伴等工作的一系列角色[1]?？紤]到它們在人類生活中的地位越來越重要，對于伴侶動物糧食的關(guān)注點也從能否提高其生產(chǎn)力轉(zhuǎn)變?yōu)槟芊窀纳破浣】?、壽命和生活質(zhì)量。這種轉(zhuǎn)變直接體現(xiàn)在功能糧的出現(xiàn)，功能糧作為一種新興產(chǎn)品，除提供必需的營養(yǎng)素外，更重要的是能夠促進機體健康[2]。功能糧的有效成分包括植物提取物、纖維、關(guān)節(jié)補充劑、非必需營養(yǎng)素或微生物和酵母衍生產(chǎn)品，可通過發(fā)揮預(yù)防或治療作用來提高寵物食品的價值[3]。益生菌幾個世紀(jì)以來一直用于人類食品發(fā)酵生產(chǎn)，如酸奶、奶酪、葡萄酒和面包等，近些年被視為健康食品的促進補充劑[4]。但益生菌對寵物的功效是一個相對較新的研究領(lǐng)域，文章對益生菌在寵物食品中的應(yīng)用進行了綜述并展望了潛在發(fā)展方向。

1 益生菌

益生菌是指對人類或動物有益的一類活性微生物[5]，主要包括細(xì)菌和酵母等。對于動物而言，益生菌通常具有提高其生產(chǎn)性能[6-7]以及抗病力[8]的作用，同時也具有一定的替代抗生素的潛力。益生菌是活的微生物，當(dāng)給予足夠的量時，會給宿主健康帶來益處[9]，據(jù)估測，2020—2027年間益生菌強化食品市場預(yù)計將從480億美元增長到940億美元，復(fù)合年增長率為7.9%。然而相對于人類和畜禽，益生菌在貓和犬上的應(yīng)用研究仍較為缺乏。PubMed數(shù)據(jù)庫中1990—2021年間以“人類”和“益生菌”為關(guān)鍵詞搜索中相關(guān)出版物超過20 000篇，而以“犬”和“益生菌”為關(guān)鍵詞僅搜索到相關(guān)出版物僅有約250 篇。盡管研究較少，但益生菌在寵物補充劑、食品和零食中得到快速的推廣應(yīng)用，并且已經(jīng)通過了部分臨床實踐[10-13]。美國食品和藥物管理局獸醫(yī)中心與美國飼料控制官員協(xié)會（AAFCO）于1989 年首次發(fā)布了可用于豬和家禽等動物飼料的細(xì)菌和酵母生物清單，經(jīng)過多年的修訂，目前有41 種非產(chǎn)毒細(xì)菌被認(rèn)為可安全應(yīng)用于伴侶動物食品中[14]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許使用的飼料微生物添加劑的菌種有34 種，分為乳酸菌類、芽孢桿菌類、酵母菌類和光合細(xì)菌類等[15]。這些微生物可以根據(jù)生理特征如細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、耐氧性以及是否形成孢子來進行分類。

2 益生菌菌株選擇標(biāo)準(zhǔn)

一般來說，作為候選益生菌不但要滿足安全和監(jiān)管指南要求，還應(yīng)對胃腸道中兩種主要化學(xué)應(yīng)激源（酸、膽汁鹽）具有一定程度的抵抗力[16-18]。此外，任何用于商業(yè)加工寵物食品的菌株都應(yīng)該在溫度等外部條件發(fā)生變化或和食品本身化學(xué)成分（即基質(zhì)酸度、氧氣存在、水活性或存在微生物抑制劑[19]）發(fā)生變化時表現(xiàn)出較高的耐受性。寵物食品中添加益生菌與傳統(tǒng)寵物食物相比可以提高產(chǎn)品的感知價值[20]，但如果在選擇益生菌時沒有考慮上述特征，實際應(yīng)用效果難以保證。研究人員通過對市面上的寵物食品調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，53%的抽樣商業(yè)產(chǎn)品標(biāo)簽上的菌株分類和菌落形成單位保證值方面存在嚴(yán)重不足[21]，這表明需要對益生菌菌株活性進行驗證，以確保動物食用時菌株的活性。

益生菌的代謝活動具有菌株特異性，同一細(xì)菌的不同菌種或菌株并非都具有相同的代謝途徑[22]。腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌是動物最常用的益生菌，它們的主要終產(chǎn)物為乳酸。傳統(tǒng)意義上產(chǎn)乳酸菌株是革蘭氏陽性厭氧菌或兼性厭氧菌且不形成孢子[23]，但這些菌株會產(chǎn)生其他物質(zhì)，例如過氧化氫和細(xì)菌素，這些物質(zhì)會影響宿主微生物群[24]。近期報道中系統(tǒng)評價了上述益生菌對犬的健康益處，包括改善糞便質(zhì)量和對表觀全消化道消化率、微生物發(fā)酵終產(chǎn)物以及免疫系統(tǒng)反應(yīng)的綜合影響[25-27]。然而，可應(yīng)用于食品中的營養(yǎng)細(xì)胞（正常生活的細(xì)菌細(xì)胞）較易因烹飪和在胃腸道環(huán)境等壓力而受損和死亡，因此需要使用例如微囊化等細(xì)胞保護技術(shù)等來增強這些微生物的存活率[28]。這是一個不斷發(fā)展的研究領(lǐng)域，對于含有非孢子形成益生菌的功能性食品的未來至關(guān)重要。

3 寵物食品加工工藝對益生菌的影響

絕大多數(shù)寵物食品都需經(jīng)過一定程度的烹飪或滅菌，以達到延長保質(zhì)期并降低病原微生物等在成品中持久存在的風(fēng)險的目的。熱處理可減少或破壞有害微生物活性，但如果處理不當(dāng)，加熱過程也可能對益生菌造成破壞，導(dǎo)致其細(xì)胞外膜和肽聚糖壁、細(xì)胞質(zhì)膜完整性的喪失以及細(xì)胞器、RNA、DNA 和酶的變性[29]，選用適當(dāng)?shù)募庸し椒ㄓ葹橹匾?/p>

3.1 擠壓

擠壓是當(dāng)今寵物食品商業(yè)生產(chǎn)中使用最廣泛的技術(shù)，研究表明在擠壓過程中施加到食物的熱能與機械能的比率會影響寵物食品顆粒的結(jié)構(gòu)特征[30-31]。嗜熱微生物如芽孢桿菌菌種由于具有較高的耐熱性，可根據(jù)其數(shù)量變化來判斷加工工藝能否實現(xiàn)滅菌作用，因此該菌種被普遍應(yīng)用于工藝驗證研究[32]。Okelo等[32]研究中將擠壓機機筒出口溫度、糖漿進料水分含量和機筒停留時間等因素組合在一起形成了15 種工藝組合，結(jié)果表明當(dāng)飼料在24.5%水分含量、3 s 停留時間和82 ℃或更高模具溫度擠壓時沙門氏菌無存活，嗜熱芽孢桿菌仍有存活，證明了形成孢子的微生物在擠壓過程中具有存活下來的潛力。

3.2 蒸煮烹飪

大多數(shù)寵物食品的蒸煮烹飪過程需要在低酸高水分條件下注入蒸汽，使產(chǎn)品加熱至121 ℃以上，目的是消除營養(yǎng)性病原體和腐敗微生物以及肉毒桿菌孢子，最終使產(chǎn)品實現(xiàn)無菌。根據(jù)食品成分和包裝類型，在3～10 min 的升溫期間將殺菌鍋升溫，并于121 ℃下保持至少2 min，如果這種病原體恰好存在于原材料基質(zhì)中，則保持時間必須足夠長以實現(xiàn)孢子數(shù)量的減少。烹飪過程的嚴(yán)苛條件使得最頑強的微生物也難以存活，但包括益生元和后生元等在內(nèi)的功能性成分可能會被保留。

3.3 冷凍干燥

冷凍干燥被認(rèn)為是一種相對溫和的脫水過程，冷凍干燥過程沒有外部熱量并且使用冷凍干燥法去除水的速度很慢。隨著市場對具有高生物利用度和較少熱處理的產(chǎn)品的需求不斷增加，冷凍干燥的寵物食品和零食在過去十年中受到市場歡迎。由于產(chǎn)品在沒有外部熱量的情況下脫水，因此冷凍干燥不被視為烹飪過程，但根據(jù)產(chǎn)品的設(shè)計，凍干寵物食品配方中使用的成分可以是預(yù)煮的或生的。寵物食品中使用的許多益生菌制劑最初都是借助保護性介質(zhì)通過冷凍干燥來保存的，這種保護性介質(zhì)有助于防止細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)因細(xì)胞核中流失水分而受損，從而延長了益生菌培養(yǎng)物的貨架期。益生菌脫水后由于其細(xì)胞含水量已經(jīng)很低，凍干過程中除去的水分主要來自細(xì)胞外周而非細(xì)胞內(nèi)，因此比未脫水的益生菌更適合與糧食混合后進行冷凍干燥。對于未脫水的營養(yǎng)細(xì)胞，凍干過程會使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而損傷細(xì)胞[33]。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁內(nèi)存在較薄的肽聚糖層和脂多糖，因此革蘭氏陰性菌相對于革蘭氏陽性菌株的存活率較低[34]。然而，冷凍干燥對活細(xì)胞的破壞作用不足以減輕食源性病原體的風(fēng)險，因此許多凍干寵物食品和零食可能會經(jīng)過獨立于凍干循環(huán)的輻照或高壓處理等對其進行額外加工。

3.4 烘焙

烘焙在面包、零食、蛋糕、玉米餅、糕點、餡餅、寵物零食、寵物食品等產(chǎn)品加工過程中應(yīng)用廣泛。傳統(tǒng)的烘焙產(chǎn)品主要由谷物粉組成，但基于肉類配方的烘焙產(chǎn)品在寵物食品行業(yè)也較為常見。烘焙過程中活微生物遇到的主要壓力源是熱量，烘焙持續(xù)的時間和溫度足以滅活大腸桿菌或沙門氏菌病原體，但目前尚未有針對不同烘焙過程中病原菌或直接可飼喂微生物滅活效果的科學(xué)驗證。有試驗表明，在190.6 ℃條件下經(jīng)過17 min的烘焙，腸道沙門氏菌亞種由8 log CFU/g減少至3 log CFU/g，而烘焙21 min才能減少至1.9 log CFU/g[35]；在傳統(tǒng)烤箱中烘焙13 min 的漢堡面包需要高達218.3 ℃才能達到減少至2 log CFU/g[36]。這表明微生物存活率的可變性可能取決于烘焙溫度和時間以及微生物固有的耐熱特性。為了規(guī)避熱應(yīng)激，將益生菌細(xì)胞包裹在烘焙產(chǎn)品表面的可食用薄膜或涂層中是一種具有發(fā)展前景的方法，在以海藻酸鈉為底物的成膜溶液中，濃縮乳清蛋白可將益生菌懸浮在上述凝膠中，用作烘焙食品的局部涂層。由94%的水、5%的淀粉和1%的微膠囊化益生菌組成的功能性淀粉基涂層應(yīng)用于面包并于180 ℃下烘焙16 min 后，微膠囊化嗜酸乳桿菌的存活率達到63%[37]。研究表明，植物乳桿菌（CIDCA83114 菌株）在30 ℃烘焙40 min 后，使用玉米淀粉基薄膜（活細(xì)胞計數(shù)減少4 個對數(shù)）比海藻酸鈉薄膜（活細(xì)胞計數(shù)減少6 個對數(shù)）提高了存活率[38]，這表明基于淀粉的懸浮液可能比其他薄膜更有效地保護烘焙條件下的益生菌活性?？紤]到微生物制備、寵物食品和治療配方中使用的原材料、應(yīng)用方式和加工條件等各個環(huán)節(jié)涉及的范圍較廣，有必要將益生菌活性驗證作為商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)流程的一部分。

4 益生菌在伴侶動物中的功效研究現(xiàn)狀

貓和犬的消化系統(tǒng)相對簡單，適合消化高蛋白質(zhì)的食物。相對于犬，貓是相對嚴(yán)格的食肉動物，對葡萄糖等碳水化合物利用率低，對高蛋白質(zhì)食物的要求更高[39]；雖然犬與貓有許多相同的解剖學(xué)和代謝特征，但犬更偏向于雜食，可消化、吸收和代謝大量碳水化合物[40]。由于貓和犬具有不同的飲食需求和消化系統(tǒng)，它們對益生菌的需求以及益生菌產(chǎn)生的效果也不同。

4.1 犬用益生菌

胃腸道疾病是犬類最常見的健康問題之一[41]，大多數(shù)表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉，在某些情況下表現(xiàn)為嘔吐或厭食[42]。已有研究表明不同類型的益生菌對于治療犬的腸道疾病具有積極結(jié)果[43]。目前在犬上研究應(yīng)用較多的益生菌包括乳桿菌屬（Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）。例如，飼喂犬源約氏乳桿菌（L.johnsoniiCPN23）能夠降低雌犬血漿葡萄糖和膽固醇水平，并增加高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比率[44]，同時增加提高其纖維消化率，增加糞便短鏈脂肪酸濃度、降低氨濃度[45]；飼喂犬源發(fā)酵乳桿菌（L.fermentumCCM 7421）能夠提高犬只糞便乳酸菌數(shù)量、降低梭菌數(shù)量，改善血液中的總蛋白質(zhì)、膽固醇和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平[46]；此外，飼喂鼠乳桿菌（L.murinusLbP2）[47]或嗜酸乳桿菌（L.acidophilusD2/CSL）[48]能夠改善犬只體況評分、糞便稠度、精神狀態(tài)及食欲。腸球菌研究方面，飼喂屎腸球菌（E.faeciumDSM 32820）犬只在整個試驗過程中具有最佳的糞便稠度，刺激了血液吞噬細(xì)菌活性和白細(xì)胞代謝活性[49]；飼喂屎腸球菌（E.faeciumSF68）能夠改善犬只腹瀉癥狀并消除賈第鞭毛蟲包囊[50]，同時提高三酰甘油濃度并降低膽固醇濃度[51]。除上述兩類益生菌之外，也有研究發(fā)現(xiàn)飼喂雙歧桿菌（Bifidobacterium animalisBb12）的犬只糞便中三酰甘油和白蛋白濃度顯著降低，乙酸、乙酰乙酸和戊酸濃度增加[52]。益生菌之間也可能存在協(xié)同作用，例如，同時飼喂犬只乳桿菌（L.caseiZhang 和L.plantarumP-8）和雙歧桿菌（B.animalissubsp.lactisV9）能夠顯著提高其平均日采食量和平均日增重，增加糞便中的有益細(xì)菌并減少潛在有害細(xì)菌數(shù)量[53]。

4.2 貓用益生菌

與犬相比，益生菌在貓中使用的研究較少，而且由于生理特征和日糧組成的差異，益生菌對貓生長和健康的作用功效無法完全從犬的研究結(jié)果中推斷[54]。與犬相似的是，在貓上研究應(yīng)用的益生菌主要也是乳桿菌屬和腸球菌屬，其中屎腸球菌SF68 對貓的益生作用研究較多：幼貓階段，屎腸球菌SF68 能夠通過提高CD4+淋巴細(xì)胞比例改善其免疫力[55]；在成年貓階段，屎腸球菌SF68 能夠緩解其腹瀉發(fā)生率[56-57]，同時使糞便微生物多樣性，這表明微生物群更穩(wěn)定；此外，屎腸球菌SF68 對改善感染慢性貓科動物皰疹病毒1的貓腸道微生物群落穩(wěn)定性，并降低了與該病毒感染相關(guān)的發(fā)病率[58]。除屎腸球菌外，添加另一種腸球菌屬的益生菌——多毛腸球菌（E.hirae）能夠提高該菌在幼貓腸道中的定植水平[59]。乳桿菌屬方面，嗜酸乳桿菌DSM13241 可增加成年貓糞便中有益的嗜酸乳桿菌和嗜酸乳桿菌群的數(shù)量，并減少梭菌屬的數(shù)量，降低糞便pH 和血漿內(nèi)毒素濃度[54]；另一方面，嗜酸乳桿菌D2/CSL 能夠改善健康成年貓的糞便形態(tài)并增加糞便中的乳桿菌數(shù)量[60]。

5 結(jié)論

益生菌有助于促進伴侶動物的健康和保健，在實際生產(chǎn)中，益生菌產(chǎn)品主要以飼料添加劑、膳食補充劑和含益生菌食品的形式出現(xiàn)，但在寵物食品加工過程中如何保證益生菌活性、保證產(chǎn)品的功效仍存在許多挑戰(zhàn)，因此，選擇合適的菌株至關(guān)重要。在選擇寵物食品生產(chǎn)應(yīng)用中挑選益生菌菌株要考慮生理特性（尤其是耐熱性、耐氧性、耐酸和膽汁性）、穩(wěn)定方法（如孢子形成、冷凍干燥或封裝）、加工條件（包括時間、溫度、壓力、水分、水分活度、pH）、使用方法、包裝和儲存條件等，且未來在開發(fā)應(yīng)用新型益生菌菌株或在對加工條件、產(chǎn)品配方或包裝設(shè)計進行任何調(diào)整時均應(yīng)驗證益生菌的活性。