免疫親和柱在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

摘 要：利用真菌毒素的特異性質(zhì)的抗體制作而成的免疫親和柱，已經(jīng)成為一種新型凈化技術(shù)，也逐漸被廣泛地應(yīng)用于檢測真菌毒素實(shí)驗(yàn)。免疫親和柱具備的特異性質(zhì)，除了可以將樣品中的大部分干擾因素清除之外，還可以有效提升檢測方法的靈敏性，大大縮短檢測時間，減少溶劑的使用量。

關(guān)鍵詞：免疫親和柱;真菌毒素;檢測

1 引言

在自然界中，存在著大量的真菌毒素，有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品會受到不同程度的真菌毒素污染，因?yàn)槊棺兾廴径鸬恼婢舅兀斐傻霓r(nóng)產(chǎn)品和工業(yè)原料損失每年可以達(dá)到數(shù)百億美元，真菌毒素對食品的生產(chǎn)者和消費(fèi)者造成的傷害不容小覷。常見的真菌毒素的檢測方法有免疫分析法和儀器分析法，免疫親和高效液相色譜熒光檢測技術(shù)是當(dāng)前真菌毒素檢測能力驗(yàn)證中發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)。王韋崗[1]等建立了復(fù)合免疫親和柱-在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜同時測定谷物及其制品中9種真菌毒素的檢測方法，該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確。真菌毒素免疫親和柱主要利用真菌毒素抗體作為配基來吸附真菌毒素，具有較好的靶標(biāo)識別性和特異性，可以去除樣品基質(zhì)干擾，降低真菌毒素凈化的損失，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，適用于混合糧食和油料基質(zhì)中低濃度真菌毒素的檢測[2]。本文對免疫親和柱在真菌毒素檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了相關(guān)的總結(jié)與分析，為免疫親和柱的應(yīng)用與發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

2 真菌毒素的概念

真菌毒素是真菌在適宜的溫度和濕度條件下，發(fā)生次級代謝反應(yīng)從而產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，糧食和飼料衛(wèi)生安全部門又將其稱為霉菌毒素，真菌嗜氧，在無氧條件下，真菌幾乎無法存活，因此人們?yōu)榱吮苊夤任锉徽婢舅匚廴?，一般會使用真空和氮?dú)鈨Υ娴姆绞剑瑥亩行Х乐拐婢舅氐漠a(chǎn)生。目前，相關(guān)研究已經(jīng)分離和鑒定出來的真菌毒素種類有400多種，但是在糧食行業(yè)領(lǐng)域中，常見的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮與赭曲霉毒素A4種真菌毒素[3]。

2.1 真菌毒素的來源

真菌毒素的來源大致分為2類：作物收獲前的真菌毒素污染，作物收獲后的真菌毒素污染[4]。

2.1.1 收獲前的真菌毒素來源渠道

任何在生長階段的農(nóng)作物，包括飼草以及谷物等，在受到真菌污染時，都極易產(chǎn)生真菌毒素。真菌在跟隨農(nóng)作物由田間向飼料加工廠再到飼料槽的這一流轉(zhuǎn)過程中，不太可能會存活下來，即使有少部分的真菌存活下來，而在檢測飼料的常見指標(biāo)時，如果飼料的原料成色以及外觀看起來都很好，那么這些看起來成色以及外觀很好的飼料原料就有可能成為真菌毒素的避難所。

2.1.2 收獲后的真菌毒素來源渠道

收獲后的農(nóng)作物，如果其儲存、運(yùn)輸、加工的溫度以及濕度條件滿足真菌生長的外部環(huán)境需求，那么真菌就會繼續(xù)生長，直至霉變產(chǎn)生真菌毒素。如果糧食、飼料在收獲儲存過程中，沒有充分進(jìn)行干燥處理，在儲運(yùn)過程中溫度和濕度過高，就會導(dǎo)致真菌迅速生長，這時真菌毒素就會大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致動物機(jī)體受到危害。

2.2 真菌毒素的特點(diǎn)

2.2.1 高效性

毒素濃度較低的真菌毒素依然可以產(chǎn)生十分強(qiáng)大的毒性，在糧食、飼料中常見的幾種真菌毒素中，黃曲霉素B1的毒性最強(qiáng)，其毒性強(qiáng)度是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛(wèi)生組織腫瘤研究機(jī)構(gòu)定義為一類致癌物質(zhì)。并且黃曲霉素B1十分普遍，在農(nóng)作物和飼料中廣泛存在，黃曲霉毒素主要損傷人體的肝臟器官，使其產(chǎn)生癌變、畸形、病變等反應(yīng)，主要引發(fā)肝癌，甚至?xí)l(fā)骨癌、腎癌、直腸癌與乳腺癌等。

2.2.2 高穩(wěn)定性

真菌毒素屬于低分子化合物，其結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，耐高溫。黃曲霉素的化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，即使是在100℃的高溫條件下儲存20h也無法完全消滅，需要溫度達(dá)到280℃的高溫條件，才能破壞其化學(xué)性質(zhì)。

2.2.3 富集性

真菌毒素具備抗化學(xué)與物理試劑的特點(diǎn)，可以在生物鏈中傳播、富集。在土壤中的真菌毒素會被谷物吸收，從而引起真菌毒素污染問題。

2.2.4 特異性

真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)不同，其產(chǎn)生的毒性差異十分大，比如黃曲霉毒素就有B1、B2、M1與M2等結(jié)構(gòu)類型，它們的毒性各不相同。

2.2.5 相加性

2種以上的真菌毒素混合在一起產(chǎn)生的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一毒素累加產(chǎn)生的毒性，農(nóng)作物大多是被幾種真菌毒素混合污染的，因此飼料中很有可能同時存在幾種真菌毒素。

2.2.6 污染地域性

動物飼料以及農(nóng)作物中的真菌毒素都有一定的地域性特點(diǎn)，比如，熱帶和亞熱帶地區(qū)的真菌毒素大多都是曲霉菌毒素，但是，由于貿(mào)易的全球化發(fā)展，導(dǎo)致飼料農(nóng)作物的真菌毒素依然會在全球范圍內(nèi)傳播。

2.2.7 隱蔽性

真菌毒素在檢測時常會受到小分子物質(zhì)比如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸酯和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的覆蓋，這些小分子物質(zhì)會與真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)融合在一起，導(dǎo)致檢測值顯示陰性，真菌毒素被掩蓋，傳統(tǒng)的檢測分析方法是無法檢測出來的，但是這些與真菌毒素所結(jié)合的小分子物質(zhì)，會在人體消化過程中被分解掉，從而將真菌毒素釋放出來，導(dǎo)致人體和動物的健康受到危害。

3 免疫親和柱概述

免疫親和柱是免疫親和層析柱的簡稱，也常常被稱為親和柱、親和層析柱等，它是運(yùn)用抗原抗體的特異性、可逆結(jié)合特性的SPE技術(shù)，根據(jù)抗原抗體的高選擇性，從復(fù)雜結(jié)構(gòu)的待測樣品中提取出一種目標(biāo)化合物。它的主要原理是將抗體惰性微珠進(jìn)行等價結(jié)合，然后將其裝柱，再將抗原溶液通過免疫親和柱，最后用洗脫緩沖液將抗原洗脫出來，最后得到純凈的抗原。

3.1 免疫親和柱的抗體來源

免疫親和柱使用的抗體可以通過單克隆技術(shù)進(jìn)行制作，也可以通過多克隆的方式制作，多克隆的抗體制作工藝十分簡單，效用也十分高，但是容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，批次生產(chǎn)的抗體之間的差異很大;單克隆抗體制作工藝相對復(fù)雜，它是通過雜交瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方式產(chǎn)生的，特異性較高，可以有效防止批次生產(chǎn)的差異，產(chǎn)品質(zhì)量十分穩(wěn)定[5]。

3.2 溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

抗原抗體發(fā)生反應(yīng)的最佳溫度是在25℃左右，因此實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度最好控制在25℃左右，過高或者過低都會影響到親和柱的回收率，如果親和柱是在4～8℃的環(huán)境中保存的，那么在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時最好將親和柱的溫度恢復(fù)到25℃左右，0℃以下的環(huán)境對于實(shí)驗(yàn)十分不利。

4 免疫親和柱在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

針對黃曲霉素系列的B1、B2、G1、G2與M1，伏馬菌素B1、B2，玉米赤霉烯酮，棕曲霉毒素A以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素的免疫親和柱已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商品化，其他真菌毒素的免疫親和柱，如桔青霉素、展青霉素、雜色曲霉素等的單克隆抗體也已研發(fā)出來，但是相關(guān)的免疫親和柱產(chǎn)品還未出現(xiàn)。

4.1 黃曲霉毒素

近30年來，食品與飼料中的黃曲霉毒素污染問題一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)問題，這種毒素是由黃曲霉屬的真菌在食物或者飼料中長期生長而產(chǎn)生的一種有毒代謝物。當(dāng)溫度與濕度條件達(dá)到真菌生長環(huán)境需求時，黃曲霉屬真菌就會無限繁衍，并產(chǎn)生黃曲霉毒素，黃曲霉毒素對人體和動物的危害十分嚴(yán)重。選用適當(dāng)?shù)臏y定方法對食品中的黃曲霉毒素進(jìn)行測定已經(jīng)成為了行業(yè)領(lǐng)域廣泛關(guān)注的一個問題。Matumba L等[6]采用免疫親和柱與酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)合的方式對土耳其市場上75個胡椒粉樣品進(jìn)行了檢測，這75個胡椒樣品中，黃曲霉B1的含量在0.11～24.7 μg/kg，其中有一個樣品的黃曲霉毒素含量高于國家規(guī)定的限量值;2011年，楊小麗等[7]對動物類藥材中的黃曲霉毒素進(jìn)行了測定，樣品在經(jīng)過提取之后，通過免疫親和柱進(jìn)行凈化，最后得到的回收率在78.8%～106.7%，證明免疫親和柱在黃曲霉毒素檢測中的靈敏度和重現(xiàn)性良好，適用于動物類藥材中的黃曲霉毒素的定量分析。在2003年，國家發(fā)布的黃曲霉素測定文件中，也將免疫親和柱作為凈化黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。

4.2 伏馬毒素

伏馬毒素的檢測方法主要有高壓液相色譜法、TLC法和酶聯(lián)免疫吸附法3種，但是隨著免疫親和柱法在真菌毒素檢測中使用的不斷推廣，一些研究者也逐漸開始使用免疫親和柱法對伏馬毒素進(jìn)行凈化，發(fā)現(xiàn)其凈化的靈敏度與抗干擾能力很強(qiáng)，絲毫不比其他幾種測定方法遜色。Solfrizzo M等[8]使用免疫親和柱與高壓液相色譜法結(jié)合的方式對嬰兒玉米粉中的伏馬毒素B1和B2進(jìn)行了萃取，測定出樣品的加標(biāo)濃度，伏馬毒素B1約80～800 μg/kg，伏馬毒素B2約20～200 μg/kg。2010年，國家發(fā)布了相關(guān)的文件，將免疫親和柱作為伏馬毒素凈化萃取的標(biāo)準(zhǔn)方法。

5 結(jié)語

我國的谷物霉變?yōu)暮χ饕l(fā)生在長江以南的地區(qū)，每年因?yàn)槊棺兾廴緦?dǎo)致的糧食減產(chǎn)比例在3%～7%。有關(guān)調(diào)查顯示[9]，除了糧食、飼料中存在真菌毒素污染問題以外，在油料作物、種子、蔬菜、干果、調(diào)味品、煙草與乳制品等產(chǎn)品中都發(fā)現(xiàn)有不同程度的真菌毒素污染問題，真菌毒素污染給人體帶來的疾病與傷害不可估量。免疫親和柱具有高靈敏度、檢測速度快、操作簡便等特點(diǎn)，在真菌毒素的檢測中具有良好的效果，因此，應(yīng)不斷研發(fā)和推廣免疫親和柱在真菌毒素檢測中的使用深度與廣度。

參考文獻(xiàn)

[1]王韋崗，強(qiáng)敏，端禮欽.復(fù)合免疫親和柱-高效液相色譜法同時測定谷物及其制品中9種真菌毒素[J].色譜，2018，36（12）：1330-1336.

[2]吳限鑫，林秋君，郭春景，等.國內(nèi)外主要糧油產(chǎn)品中真菌毒素限量、檢測標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險評估現(xiàn)狀分析[J/OL].中國糧油學(xué)報，[2019-09-19].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2864.ts.20190819.1523.032.html.

[3]趙瓊暉，袁梓洢，王宏菊，張建瑩.食品中修飾型真菌毒素及其同時檢測方法研究進(jìn)展[J/OL].食品工業(yè)科技，[2019-09-19].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20190801.1134.018.html.

[4]佚名.常見真菌毒素的解讀及其檢測方案[J].食品安全導(dǎo)刊，2019（19）：40-43.

[5]楊超，林洪，張輝珍，等.免疫親和柱凈化高效液相色譜檢測啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007（12）：127-129.

[6]Matumba L， Sulyok M， Njoroge S M C， et al. Uncommon occurrence ratios of aflatoxin B1， B2， G1， and G2 in maize and groundnuts from Malawi[J]. Mycotoxin Research，2015，31（1）：57-62.

[7]楊小麗，韋日偉，申紅紅，等.免疫親和柱凈化光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測法測定動物類藥材中黃曲霉毒素[J].中國藥業(yè)，2011，20（15）：4-5.

[8]Solfrizzo M， Girolamo A D， Visconti A. Determination of fumonisins B1 and B2 in cornflakes by high performance liquid chromatography and immunoaffinity clean-up[J]. Food Additives and Contaminants，2001，18（3）：227-235.

[9]王秀嬪，李培武，張奇，等. 能力驗(yàn)證中糧油真菌毒素檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報， 2019，41（4）：650-656.

作者簡介：路雅婷（1984—），女，山東淄博人，碩士，工程師。研究方向：真菌毒素的檢測。