分子技術(shù)在流感病毒檢測中的應(yīng)用探討

陳小青

【摘? 要】流行性感冒是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，流感病毒具有流行與不斷復(fù)制重組的能力，不但傳染性極大，傳播速度也非?？?，使得流感成為整個世界公共衛(wèi)生的重大威脅。近年來，全球范圍內(nèi)流感頻頻爆發(fā)，快速控制并治療流感的需求，要求對每一種流感病毒都能夠快速檢測的出來，而具有檢測速度快，檢測靈活敏感，并且特異性高的分子檢測技術(shù)對預(yù)防與控制流感的傳播和實驗室檢測工作而言，異常重要。

【關(guān)鍵詞】分子技術(shù);流感病毒;檢測;

【中圖分類號】R372????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）01-0294-02

流行性感冒主要由流感病毒感染引起，具有高傳染性，且可以通過空氣、污染物與人際接觸傳染，傳播速度極快。感染了流感病毒后，往往很快就出現(xiàn)發(fā)熱、高燒、全身乏力、疼痛等癥狀，并且呼吸道會出現(xiàn)病征，尤其是老年、嬰幼兒與存在心肺疾病的患者極易并發(fā)肺炎等重病，甚至導(dǎo)致死亡，具有巨大的破壞性。流感病毒由分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA組成基因組，根據(jù)其核蛋白（NP）和膜蛋白（MP）的不同，可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型，尤其是甲型流感病毒易發(fā)生抗原變異，傳染性大，非常容易造成大規(guī)模流行性疾病[1]。甲型流感病毒根據(jù)抗原的不同還分為9個NA亞型與16個HA亞型，這兩種亞型抗原又可以通過轉(zhuǎn)換形成新的亞型，而亞型新病毒極可能出現(xiàn)并引發(fā)更大型的流行性流感。因此，能否快速、精準(zhǔn)的檢測出流感病毒對于治療與控制流感病毒的傳播與疫情十分重要。分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使得分子技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，在流感病毒的檢測中也發(fā)揮這非常重要的作用。

1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對流感病毒的檢測主要是通過在非常短暫的時間里增加大量的特定DNA片段來實現(xiàn)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，聚合酶鏈反應(yīng)在進(jìn)行病毒檢測時僅僅需要少量的樣本就可以實現(xiàn)檢測，且其重復(fù)性好，檢測速度快、敏感高效，從收集樣本到最終檢測出結(jié)果最少需要2小時，最多需要24小時即可。

聚合酶鏈反應(yīng)法包括普通RT-PCR法、多重RT-PCR法與實時熒光定量法，其中，普通RT-PCR法主要是對NA基因片段與HA基因片段進(jìn)行檢測，目前對未知流感病毒的基因片段進(jìn)行兼并引物來進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而達(dá)到分型的目的。多重RT-PCR法則可以一次只對一種病毒進(jìn)行檢測，也可以同時對多種病毒進(jìn)行檢測，但需要應(yīng)用多對引物組合進(jìn)行分型檢測。其同樣具有高度的靈敏度與特異性，檢測高效，同時檢測多種病毒成本更低，更適用于臨床檢測應(yīng)用中。實時熒光定量檢測法指將熒光基因加入到聚合酶鏈反應(yīng)體系中，通過熒光信號在檢測過程中的實時積累來進(jìn)行檢測，并以此來展開定量分析。該方法不但具有普通聚合酶鏈反應(yīng)方法的強(qiáng)特異性、高度敏感、具有重復(fù)性等優(yōu)點，同時由于熒光因子能夠更直觀的檢測到，大幅度降低了檢測到假陽性的可能性[1]。

2 依賴核酸序列的擴(kuò)增法（NASBA）

依賴核酸序列的擴(kuò)增法的檢測靈敏度與特異性都比聚合酶鏈反應(yīng)檢測的高，且其擴(kuò)增的效率更高，操作也相對簡單，然而，該法在檢測前必須優(yōu)化引物，且在病毒檢測中還存在某些病毒出現(xiàn)假陽性或靈敏度不足的現(xiàn)象。它主要由一對引物進(jìn)行引導(dǎo)，以及一種連續(xù)的均一的特異單鏈RNA做恒溫的擴(kuò)增產(chǎn)生反應(yīng)的過程。依賴核酸序列的擴(kuò)增法應(yīng)用廣泛，多應(yīng)用于禽流感病毒檢測、呼吸道病毒檢測中，目前，醫(yī)學(xué)研究界已經(jīng)對NASBA檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，現(xiàn)在的NASBA檢測技術(shù)已經(jīng)可以實現(xiàn)實時檢測，能夠定量檢測，使其檢測的特異性與靈敏性大大提高，目前已廣泛應(yīng)用于A、B兩型流感病毒、呼吸道病毒的檢測，能夠快速分離出乙型、H3N2、H1N1流感病毒。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（LAMP）簡單的說就是一種擴(kuò)增核酸的方法，通過應(yīng)用4種具有特異性的引物，聯(lián)合DNA聚合酶置換作用，在恒溫狀態(tài)下，對靶基因的多個區(qū)域進(jìn)行核酸擴(kuò)張。該法的可操作性強(qiáng)、簡單，也不需要特定的試劑與儀器，LAMP只有兩種結(jié)果，一是擴(kuò)增，二是不擴(kuò)增，只需要查看反應(yīng)物染色后的顏色以及試劑的渾濁程度就能夠進(jìn)行結(jié)果判定。目前，LAMP技術(shù)已非常成熟，以及研發(fā)出了多種針對性強(qiáng)的檢測技術(shù)，比如針對新甲型H1N1流感病毒檢測的技術(shù)、針對季節(jié)性流感病毒的檢測技術(shù)以及針對H3N2病毒的檢測技術(shù)等。

4 基因芯片

基因芯片（genechip）（又稱DNA芯片、生物芯片），其測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針[2]。通過探針與樣品進(jìn)行雜交，再通過對雜交信號進(jìn)行檢測來判斷生物樣品數(shù)量的多少?；蛐酒瑱z測的穩(wěn)定性高，具有良好的重復(fù)性與并行性，檢測速度快，效率高，唯一缺陷是其操作繁瑣，尤其對檢測設(shè)備等條件的要求很高，難以適用于一般實驗室的病毒檢測，但用于調(diào)查流行病學(xué)與開展醫(yī)學(xué)科學(xué)研究卻效果顯著。

近年來，分子生物學(xué)的研究取得了長足的進(jìn)步，對流行感冒病毒的檢測技術(shù)也更加成熟與多樣了。本文主要介紹了聚合酶鏈反應(yīng)檢測法、依賴核酸序列的擴(kuò)增法、 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法與基因芯片檢測技術(shù)，此外還有納米技術(shù)、核酸探針技術(shù)、基因測序技術(shù)、原位雜交技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等[3]。但目前我國在預(yù)防與監(jiān)控流感病毒上，應(yīng)用得最多的還是聚合酶鏈反應(yīng)檢測法，其他檢測方法較少使用，但隨著分子技術(shù)的研究更加深入，檢測技術(shù)與條件的更加完善，我國也將加大其他檢測技術(shù)在日常流感病毒的預(yù)防檢測工作中的應(yīng)用，同樣，這些技術(shù)也將在流感病毒防控工作中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1]?? 劉鳳.分子技術(shù)在流感病毒檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（12）：2249-2251.

[2]?? 李勃，孫菲，李文悌，王曉春.分子技術(shù)在流感病毒診斷中的應(yīng)用[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（16）：1992-1994.

[3]?? 于新友，李天芝，莫玲，沈志強(qiáng).分子生物學(xué)技術(shù)在鴨坦布蘇病毒檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].水禽世界，2015（04）：36-39.