UPLC-MS/MS法測定食品中五氯酚及其鈉鹽的不確定度分析

譚美齡 閻睿 譚順中

摘 要：目的：評定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中五氯酚及其鈉鹽的不確定度。方法：根據(jù)JJF 1135-2005、JJF 1059.1-2012和CNAS-GL 06：2006中的相關(guān)規(guī)定，建立測定食品中五氯酚及其鈉鹽的不確定度數(shù)學(xué)模型，并逐層對不確定度來源進(jìn)行分析。結(jié)果：通過對各分量進(jìn)行合成，得出當(dāng)樣品中含量為3.39 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.20 μg·kg-1（k=2）。同時(shí)根據(jù)評定結(jié)果得出，影響檢測結(jié)果的主次因素依次為：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合、方法回收率、測量重復(fù)性、量取體積及樣品稱樣量。結(jié)論：可為科學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)中的測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)，同時(shí)為測量其他農(nóng)藥獸藥殘留量的不確定度評定提供參考。

關(guān)鍵詞：五氯酚及其鈉鹽;不確定度;食品;超高效液相色譜-質(zhì)譜法

Abstract：Objective： To evaluate the uncertainty of determination of pentachlorophenol and its sodium salt in food by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Methods： According to the relevant regulations of JJF 1135-2005， JJF 1059.1-2012 and CNAS-GL 06：2006， a mathematical model of uncertainty for the determination of pentachlorophenol and its sodium salt in food was established， and the sources of uncertainty were analyzed layer by layer. Results： By synthesizing the components， the expanded uncertainty was 0.20 μg·kg-1 （k=2） when the content of the sample was 3.39 μg·kg-1. At the same time， according to the evaluation results， the main and secondary factors affecting the test results are： standard solution preparation and standard working curve fitting， method recovery， measurement repeatability， volume measurement， sample weighing. Conclusion： This study provided a basis for the scientific evaluation of the accuracy of the determination results in the experiment， and provided a reference for the evaluation of uncertainty in the measurement of other pesticides and veterinary drug residues.

Key words：Pentachlorophenol and its sodium salt; Uncertainty; Food; Ultra-high performance liquid chromatography

-mass spectrometry

中圖分類號：O657.63

五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）及其鈉鹽屬有機(jī)氯農(nóng)藥，廣泛用作殺菌劑、除草劑、殺蟲劑。由于具有水溶性，極易擴(kuò)散，造成水或土壤污染。通過食物鏈，可能對人體造成危害[1]。農(nóng)業(yè)部公告第235號《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[2]規(guī)定，其在動(dòng)物性食品中不得檢出。

除了給出被測量的最佳估計(jì)值之外，一個(gè)完整的測量結(jié)果還應(yīng)包含與該值相關(guān)的不確定度。本文根據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度的評定》[3]、

JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[4]和CNAS-GL 06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[5]

的要求，通過QuEChERS-UPLC-MS/MS評估了食品中五氯酚及其鈉鹽的測定的不確定性，旨在為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，為評估其他相關(guān)物質(zhì)檢測方法的不確定度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司;乙酸、無水硫酸鎂、乙酸銨（均為分析純）：重慶川東化工公司;C18（40 μm），安捷倫公司。甲醇中五氯酚溶液GBW（E）080475（濃度：1 mg·mL-1）：中國計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 Infinity II液相色譜系統(tǒng)：安捷倫公司;AB Sciex QTRAP? 4500三重四級桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀（配ESI離子源）：美國AB SCIEX公司;KA? MS 3 digital渦旋振蕩器：德國IKA集團(tuán);SIGMA 3-30KS高速離心機(jī)：德國SIGMA實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司;Biotage Tulbovap ? LV氮吹濃縮儀：瑞典Biotage AB公司;KQ-800DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，并配制成10 μg·mL-1的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。再移取1 mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，得到100 ng·mL-1的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用適量的空白樣品基質(zhì)溶液稀釋至10 mL，最終定容濃度為0.5、1.0、2.0、5.0 ng·mL-1及10.0 ng·mL-1。

1.3.2 樣品制備

稱取2 g樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入乙腈（含1%乙酸）25 mL，渦旋混合2 min，超聲提取20 min，以8 000 r·min-1離心5 min，取上清液至氮吹管中，于40℃下用氮?dú)獯抵两桑瑴?zhǔn)確加入4 mL甲醇溶解。取上述溶解液2 mL轉(zhuǎn)移至裝有0.25 g MgSO4、0.30 g C18的離心管中，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上述凈化液過0.22 μm濾膜用于UPLC-MS/MS測定。

1.3.3 儀器分析

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 2.1 mm×100 mm 1.9-Micron;流動(dòng)相：A甲醇、B水（含5 mmol·L-1乙酸銨）;梯度洗脫：0～1.5 min，流動(dòng)相A為10%并保持;1.5～4 min，流動(dòng)相A從10%線性增加至90%，并保持至7.50 min;7.50～7.51 min，流動(dòng)相A從90%線性回至10%，并保持至10 min;流速：

0.20 mL·min-1;進(jìn)樣量：5 μL;柱溫：35 ℃。

離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：負(fù)離子掃描;檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;電噴霧電壓：-4 500 V;霧化器蒸發(fā)溫度：500 ℃;霧化氣：50 units;輔助加熱氣：50 units;反吹氣：30 units;定量離子對：262.6>262.6;定性離子對：264.3>264.3、266.9>266.9、268.7>268.7;去簇電壓：-84 V;碰撞能量：-11 V。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

本檢測方法的數(shù)學(xué)模型見式（1）。

（1）

式（1）中：X-試樣中PCP的殘留量，μg·kg-1;C—試樣溶液中PCP的測得濃度，ng·mL-1;V-試樣溶液最終定容體積，mL;m-稱取試樣的質(zhì)量，g;f-稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度來源如圖1所示。

2.2 不確定度的評定[6-7]

2.2.1 被測物的濃度（C）引入的不確定度

在本試驗(yàn)條件下，該不確定度主要產(chǎn)生于配制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溶液和擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線兩個(gè)過程。配制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)溶液又主要分為五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液的稀釋和五氯酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制2個(gè)過程。

（1）五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液稀釋過程引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度，根據(jù)五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，相對擴(kuò)展不確定度為3%，包含因子為2，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）

第一次移液。實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度為（20±5）℃，

本試驗(yàn)采用的所有玻璃量器均為A級標(biāo)準(zhǔn)[8]，假設(shè)（1±0.007）mL單標(biāo)線吸量管容積呈三角分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）

甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.1×10-3/℃，假設(shè)在該試驗(yàn)條件下溫度波動(dòng)均勻分布，，由溫度引起的體積不確定度為：

（4）

第一次移液過程所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）

第一次定容。假設(shè)（100±0.10）mL容量瓶容積呈三角分布，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（6）

由溫度引起的體積不確定度為：

（7）

綜合第一次定容過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（8）

第二次移液和定容過程產(chǎn)生的不確定度同第一次，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（9）

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制過程引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中的5個(gè)點(diǎn)均采用（1±0.008）mL分度吸量管移取，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（10）

由溫度所引入的體積不確定度為：

（11）

合成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制過程中移液所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（12）

標(biāo)準(zhǔn)曲線中的5個(gè)點(diǎn)均采用（10±0.020）mL容量瓶定容配制，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（13）

由溫度引入的體積不確定度為：

（14）

合成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配置過程中定容所引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（15）

則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制過程所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（16）

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。分別對標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的5個(gè)點(diǎn)重復(fù)測定2次，得到的峰面積見表1。擬合而成的線性回歸方程為：y=1 243 820x+

172 037，相關(guān)系數(shù)為：r=0.999 96。

回歸方程的估計(jì)誤差S計(jì)算公式如式（17）所示。

（17）

式（17）中：n是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上點(diǎn)的測定次數(shù)（n=5×2=10），a是標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，b是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。

將數(shù)據(jù)代入式（17），得到S=4 482 651 956。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對不確定度urel計(jì)算公式如式（18）所示。

（18）

式（18）中：p為陽性樣品的測定次數(shù)（p=5），c為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的平均濃度，C0為通過工作曲線計(jì)算出的PCP濃度。

將本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)代入公式（18）中，得urel（C-3）=

0.009 34。則由被測物的濃度（C）引入的不確定度為：。

2.2.2 體積量?。╒）引入的不確定度

在該試驗(yàn)條件下，體積產(chǎn)生的不確定度主要來源于樣品溶液的定容和儀器分析中的進(jìn)樣體積。

（1）定容體積產(chǎn)生的不確定度。樣品在氮吹完后，用（5±0.025）mL分度吸量管移取甲醇復(fù)溶溶劑，根據(jù)三角分布計(jì)算不確定度：

（19）

由溫度引起的不確定度為：

（20）

合成相對不確定度為：

（21）

（2）進(jìn)樣體積產(chǎn)生的不確定度。本試驗(yàn)所用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的進(jìn)樣針吸取量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為±1%。根據(jù)均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

（22）

合成以上兩個(gè)分量的相對不確定度，則由體積量?。╒）引入的相對不確定度：

（23）

2.2.3 樣品質(zhì)量（m）引入的不確定度

根據(jù)電子天平的校準(zhǔn)證書，其最大允許誤差為±0.001 g。根據(jù)均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

（24）

2.2.4 測量重復(fù)性引入的不確定度

向空白陰性樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品制備過程同法處理，數(shù)據(jù)見表3，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差為：Sr=0.147，平均值為：x=3.39 μg·kg-1。則引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（25）

2.2.5 回收率引入的不確定度

加標(biāo)樣品的測定結(jié)果，其平均回收率r=84.44%，標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr=4.081，則由回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（26）

2.2.6 合成不確定度

合成不確定度計(jì)算公式如式（26）所示。

（27）

將數(shù)據(jù)帶入公式（27），計(jì)算可得該方法處理下，五氯酚的總合成不確定度為0.030 1。

2.2.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果報(bào)告

在本試驗(yàn)條件下，樣品中五氯酚及其鈉鹽含量的擴(kuò)展不確定度為：U=urel（X）×k×x=0.030 1×2×3.39=0.20。包含因子k=2，置信水平為95%。該樣品中五氯酚及其鈉鹽含量的結(jié)果報(bào)告為：（3.39±0.20）μg·kg-1。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS-UPLC-MS/MS法測定食品中五氯酚及其鈉鹽，依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評估了實(shí)驗(yàn)過程中溶液配制、玻璃儀器、稱重、定容體積、溫度、回收率及重復(fù)性帶來的不確定度。其中影響檢測結(jié)果的主次因素依次為：標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合、方法回收率、測量重復(fù)性、體積量取和樣品稱量。在實(shí)際操作中，應(yīng)注重準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用多次平行測定的方法降低誤差，用回收率校正測量值，以降低不確定度，確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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