D-半乳糖衰老小鼠模型的建立

劉佳

【摘? 要】目的：建立 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型建立。方法：8周齡ICR小鼠，32只，雌性各半，10%D-半乳糖溶液500mg/（kg·d）頸后部皮下注射.連續(xù)注射 56天后后摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，并通過檢測小鼠血清中 SOD 活力和 MDA 含量，對此衰老模型做出生物學(xué)鑒定。結(jié)果：造模過程中模型小鼠逐漸變得不活潑，喜蜷縮，脊椎隆起，體形消瘦，皮膚松弛，毛發(fā)稀疏、豎起失去光澤等一系列衰老體征，而正常對照組未出現(xiàn)上述衰老體征;與正常對照組相比，模型組血清SOD活力明顯降低（P<0.01），差異有顯著性意義;與正常對照組相比，血清MDA含量明顯升高（P<0.01），差異有顯著性意義。結(jié)論：本課題組成功建立了 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型。

【關(guān)鍵詞】D-半乳糖

【中圖分類號】R764????? 【文獻標(biāo)識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）04-0031-01

【Abstract】Objective：To establish a D - galactose subacute aging mice model.Methods： 8 weeks of ICR mice， 32， female and male in half，500 mg/D - galactose 10% solution （kg·D） at the back of the neck subcutaneous? injection . After 56days continuousinjection，blood were sampled from the eyes ，then the mice were executed.Through testing the SOD activity and MDA contentsin the serum， we can make biology identification of the aging mod.Results：The process of building model ，the model mice gradually became less active，liked curled， the spine upheavaled，body were thin ，skin were loose， hair were sparse，erecting and lost shineetc，a series of signs of aging，.However the normal control group did not appear the aging signs.Compared with the normal control group， the model group serum SOD activity decreased significantly （P < 0.01）;Compared with the normal control group， serum MDA contents increased significantly （P<0.01）.Conclusion：Our research group had established the D-galactose subacute aging model mice sucssessfully

【Key word】D- galactose

有文獻報道選用D-半乳糖來建立衰老動物模型時發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠相對于雌性大鼠更為敏感，可以首選雄性SD大鼠作為動物來源。但亦可選用Wistar大鼠、昆明小鼠、ICR小鼠等。目前D-半乳糖致衰老動物模型所需劑量及時間尚無統(tǒng)一規(guī)定，劑量范圍從50-1250mg/（kg·d）不等。有學(xué)者認(rèn)為，在制備D-半乳糖衰老大鼠或小鼠模型時，給D-半乳糖 50-500mg/（kg·d），連續(xù)6-8周比較合適。

本課題組選擇ICR小鼠，D-半乳糖500 mg/（kg·d），建立衰老動物模型，通過觀察各組小鼠生命狀態(tài)的變化，及血液相關(guān)生化指標(biāo)，判斷此方法是否可以成功建立衰老模型。

1 材料

1.1 實驗動物

8周齡ICR小鼠，雌雄各半，32只，體重25～30g，購自北京動物維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001，實驗過程中對動物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 動物的分組及飼養(yǎng)

32只8周齡ICR小鼠（25～30 g），雌雄各半，隨機分成正常對照組、模型組每組16只，SPF級飼養(yǎng)。整個實驗過程小鼠自由進食、飲水，飼料和水需經(jīng)過滅菌。

2.2 D-半乳糖模型的建立

每周稱重一次，依據(jù)體重頸背部皮下注射 5% D-半乳糖溶液500mg/kg﹒bw，每天早上 9：00 注射一次，連續(xù)注射56天。正常對照組小鼠注射以相同劑量的生理鹽水。在建模期間觀察記錄小鼠的生存狀態(tài)和生物學(xué)行為的動態(tài)變化并定期稱量其體質(zhì)量。

2.3小鼠形態(tài)特征的觀察及血液標(biāo)本的收集

造模期間逐日觀察小鼠生存狀態(tài)及形態(tài)特征的變化，最后一次給藥2 h后用眼科鑷摘眼球取血，放入標(biāo)記好的EP管中，離心3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清于新的 EP 管中，做好標(biāo)記，然后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4小鼠血清中總 SOD 活力、MDA的測定

SOD的抑制率（%）=（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）/（A對照-A對照空白）

SOD活力=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24ml/0.02ml）×樣本測試前稀釋倍數(shù)

血清中 MDA 含量計算公式為：MDA 含量（nmol/mL）=（測定管吸光度值-測定空白管吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）×樣本測試前稀釋倍數(shù)

計算出 MDA 含量后換算成國際單位（?mol/L），進行統(tǒng)計分析。

2.5統(tǒng)計方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS18.0 軟件，數(shù)據(jù)用表示，組間采用t檢驗。P<0.05 表示組間有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1小鼠生存狀態(tài)變化

造模過程中兩組小鼠均無出現(xiàn)死亡，模型組小鼠脊椎逐漸隆起，體形消瘦，皮膚松弛，毛發(fā)逐漸失去光澤，蓬松直豎并且變得稀疏，行動遲緩，少動，喜蜷縮;對照組小鼠則無相應(yīng)形態(tài)變化。

3.2小鼠血清SOD活力及MDA含量測定

與正常對照組相比，模型組血清SOD活力明顯降低（P<0.01），差異有顯著性意義;與正常對照組相比，血清MDA含量明顯升高（P<0.01），差異有顯著性意義。

4 討論

衰老的代謝學(xué)說，即自由基學(xué)說，認(rèn)為新陳代謝是生命的本質(zhì)，也是生命活動得以維持的基礎(chǔ)，機體的衰老是由新陳代謝障礙引起的^[1]。在三大類物質(zhì)代謝中，糖類代謝途徑處于核心地位，對整個有機體新陳代謝的正常進行有重要意義。糖類代謝紊亂必將引起心、肝、腦、腎等重要器官代謝活動的異常，最終引發(fā)機體的衰老^[2]。D-半乳糖衰老小鼠模型自1991年首次提出以來在國內(nèi)得到廣泛運用和發(fā)展。相關(guān)文獻報道發(fā)現(xiàn)該模型表現(xiàn)出與16～24月齡衰老鼠相似的學(xué)習(xí)記憶能力下降，自由基產(chǎn)生增加，抗氧化物酶活性降低，免疫功能退化等自然衰老過程中的變化^[3]。D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖和過氧化氫，使活性氧增多，脂質(zhì)過氧化亢進，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，這些活性氧成分可以降低體內(nèi) SOD、CAT、GSH-PX 等自由基清除系統(tǒng)的活力，進一步加劇體內(nèi)自由基的積累，引起機體一系列機能的損傷。同時，過量的自由基使生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸過氧化，而形成脂質(zhì)過氧化物丙二醛MDA。脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無活性脂褐質(zhì)，沉積于組織細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細(xì)胞無法維持正常代謝而死亡。在衰老現(xiàn)象中以機體生命形態(tài)特征的改變和體內(nèi)活性氧的積累最為典型，常用這些指標(biāo)作為評價衰老模型建立成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。SOD是消除自由基的酶系防御體系，MDA的生成量可以反映氧化程度的高低，目前以這兩種指標(biāo)對D-半乳糖致衰老模型建立做鑒定^[4，5]。有實驗證實，D-半乳糖可引起體內(nèi)自由基生成增多^[42]，血液總抗氧化活力下降，SOD和GSH-PX含量降低，MDA水平增高。

本實驗中模型組小鼠脊椎逐漸隆起，體形變得消瘦，毛發(fā)灰黃色、蓬松、稀疏，失去光澤，皮膚松弛，行動遲緩，少動。這些形態(tài)特征的變化與自然衰老小鼠相一致，也與相關(guān)文獻中報道的 D-半乳糖亞急性衰老小鼠形態(tài)特征的改變相一致^[6]。本實驗中模型組小鼠 SOD 活力下降，MDA 含量升高說明模型小鼠體內(nèi)自由基含量升高，同時體內(nèi)自由基的清除能力下降，這與自然衰老小鼠體內(nèi)生化指標(biāo)的改變相一致^[7]。綜合這兩個方面，說明本實驗所建立的 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型具有較高的可靠性。

參考文獻

[1]????? Frolkis VV， Grigorov YG， Pisarchuk KL. Long-term effects of litter size in early postnatal period on metabolism， aging and life span in rats[J]. Arch Gerontol Geriatr， 1993，17（1）：65-73.

[2]????? Fujimoto T， Matsumoto T， Fujita S， et al. Changes in glucose metabolism due to aging and gender-related differences in the healthy human brain[J]. Psychiatry Res， 2008，164（1）：58-72.

[3]????? 許倩， 楊松鶴， 趙聯(lián)偉， 等. 中藥天年飲對衰老大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的影響[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2007，11（12）：2368-2370.

[4]????? Giardino R， Giavaresi G， Fini M， et al. The role of different chemical modifications of superoxide dismutase in preventing a prolonged muscular ischemia/ reperfusion injury[J]. Artificial cells， blood substitutes， and immobilization biotechnology， 2002，30（3）：189-198.

[5]????? Sfeir AJ， Chai W， Shay JW， et al. Telomere-end processing the terminal nucleotides of human chromosomes[J]. Mol Cell， 2005，18（1）：131-138.

[6]????? 張彥軍， 朱華亭， 黃賽男， 等. D-半乳糖致衰老小鼠胸腺T細(xì)胞重要膜型分子的改變及其意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2012，28（2）：130-132.

[7]????? Wei H， Li L， Song Q， et al. Behavioural study of the D-galactose induced aging model in C57BL/6J mice[J]. Behav Brain Res， 2005，157（2）：245-251.