廣西靈川等4地刺莧和反枝莧對(duì)草甘膦的敏感性

歐翔 路濤 陳展冊(cè) 鄧全道 蒙月月

摘要：刺莧和反枝莧在廣西各地農(nóng)田均有分布，綜合運(yùn)用培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法、整株生物測(cè)定法對(duì)廣西4個(gè)不同地點(diǎn)的刺莧和反枝莧種群進(jìn)行草甘膦敏感性測(cè)定。結(jié)果表明，桂林靈川的刺莧和桂林興安的反枝莧對(duì)草甘膦表現(xiàn)出敏感性下降的情況。同時(shí)，使用生化指標(biāo)測(cè)定法檢測(cè)的植株體內(nèi)莽草酸含量變化情況與其敏感性變化趨勢(shì)基本一致。

關(guān)鍵詞：刺莧;反枝莧;草甘膦敏感性;莽草酸含量

中圖分類號(hào)：S482.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號(hào)：1003-935X（2019）01-0041-05

Abstract：Amaranthus spinosus and Amaranthus retroflexusto distributed in all fields in Guangxi area;samples of each species samples were separately collected at 4 sites and their response to glyphosate was evaluated by seed culturing and whole plant bioassays. A.spinosus in Lingchuan area and A.retroflexus in Xingan were less sensitive to glyphosate than those of other locations. The variation inshikimic acid content in plants detected by a biochemical index determination method was consistent with their glyphosate sensitivity.

Key words：Amaranthus spinosus;Amrarnthus retroflexus;sensitivity toglyphosate;shikimic acid content

刺莧（Amaranthus spinosus），原產(chǎn)于熱帶美洲，危害旱作物田、蔬菜地及果園，嚴(yán)重消耗土壤肥力。反枝莧（Amrarnthus retroflexus），原產(chǎn)于美洲，容易影響其他生物的生長(zhǎng)、繁殖，還可以混雜在作物種子中影響產(chǎn)量。莧屬外來(lái)有害雜草是病毒、病蟲害等的寄主[1]。刺莧和反枝莧作為農(nóng)田雜草，具有繁殖形式多、周期短、傳播速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。

草甘膦（N-磷酸甲基甘氨酸）作為廣譜滅生性除草劑，是國(guó)內(nèi)外防治一年生和多年生雜草的主要農(nóng)藥之一[2]。我國(guó)是草甘膦的生產(chǎn)和應(yīng)用大國(guó)，隨著草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用量的增加，抗草甘膦雜草的種類不斷增多，其耐藥性不斷增強(qiáng)[3-5]。

培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法是近年來(lái)除草劑抗藥性檢測(cè)領(lǐng)域使用較多的一種檢測(cè)方法，這種方法是把經(jīng)過(guò)赤霉素催芽的種子放在浸藥的濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定主根長(zhǎng)或鮮重等指標(biāo)診斷雜草的抗藥性水平[6]。為了佐證試驗(yàn)效果，本試驗(yàn)同時(shí)采用整株生物測(cè)定法對(duì)刺莧及反枝莧種子進(jìn)行栽種培養(yǎng)，測(cè)定鮮重抑制率中濃度（ED50值）;使用生化指標(biāo)測(cè)定法，用略高于整株鮮重抑制率中濃度的草甘膦溶液進(jìn)行處理，以檢測(cè)植株體內(nèi)莽草酸（shikimic acid）含量的變化情況。

本研究以廣西4個(gè)不同地區(qū)的刺莧種群和反枝莧種群為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法、整株生物測(cè)定法、生化指標(biāo)測(cè)定法來(lái)探究研究對(duì)象在不同地區(qū)間的草甘膦敏感性差異水平，將為廣西農(nóng)田防治刺莧和反枝莧雜草提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試對(duì)象

刺莧和反枝莧供試雜草種子于2017—2018年在廣西壯族自治區(qū)桂林市靈川縣道路邊、桂林市興安縣菜地邊、南寧市武鳴縣、防城港市港口附近菜地采集。

供試藥劑：草甘膦異丙胺鹽95%原藥（河北奇峰化工有限公司生產(chǎn)），莽草酸標(biāo)準(zhǔn)液（20 mg，測(cè)定用，Stanford Chemicals生產(chǎn)）。

試驗(yàn)儀器：人工氣候培養(yǎng)箱（HQH-400型），紫外分光光度計(jì)（島津UV-2550型）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法 挑選飽滿程度一致的刺莧、反枝莧種子，在0.2%、0.6%赤霉素溶液中分別浸泡24 h進(jìn)行催芽[7]。隨后用草甘膦異丙胺鹽95%原藥加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度（有效成分含量）分別為375.000、93.750、23.438、5.860、1.465、0.366、0.092 mg/L的草甘膦異丙胺鹽溶液，以蒸餾水為對(duì)照（CK）組。將種子分別放入直徑為9 cm、鋪有2張濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿20粒，每皿分別加入5 mL上述不同質(zhì)量濃度的藥液，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)[8]。培養(yǎng)周期和溫度設(shè)為白天 16 h、36 ℃，夜晚 8 h、25 ℃。培養(yǎng)10 d后測(cè)量根長(zhǎng)，計(jì)算抑制率及對(duì)應(yīng)的回歸方程，試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)由DPS軟件處理。

1.2.2 整株生物測(cè)定法測(cè)定鮮重抑制率中濃度 使用0.2%、0.6%赤霉素溶液浸泡不同地區(qū)的刺莧、反枝莧種子各80粒，24 h后分別均勻地播種在直徑10 cm、高5 cm的培養(yǎng)杯中。反枝莧種子需要覆蓋1層薄土，設(shè)定培養(yǎng)周期和溫度為白天16 h、30 ℃，夜晚8 h、25 ℃[9]。每天用噴壺澆水1次，進(jìn)行觀察培養(yǎng)。定期去除干擾雜草。

待植株長(zhǎng)至3～4葉期間，保留長(zhǎng)勢(shì)基本一致的30株苗繼續(xù)培養(yǎng)至5～6葉齡，用配制成相應(yīng)倍數(shù)濃度的95%草甘膦異丙胺藥液進(jìn)行噴灑，有效成分草甘膦的用量為600.000、150.000、37.500、9.375、2.344、0.586 g/hm2。以噴灑清水的為空白對(duì)照（CK）組，噴藥10 d后，剪取地面部分稱質(zhì)量。試驗(yàn)重復(fù)2次，計(jì)算鮮重抑制率：鮮重抑制率=（CK-草甘膦處理）/CK×100%。建立毒力方程，求出鮮重抑制率中濃度。使用DPS軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定法測(cè)定莽草酸含量 根據(jù)“1.2.2”節(jié)的方法選取植株在4～6葉齡的幼苗，用有效成分略高于最高ED50值的草甘膦濃度（4、8 g/hm2），分別對(duì)刺莧和反枝莧的莖葉進(jìn)行噴霧處理[9]，以未經(jīng)草甘膦處理的植株作為試驗(yàn)CK組，于試驗(yàn)后0、1、3、5、7、9 d分別剪取植株莖葉進(jìn)行莽草酸含量的測(cè)定。

采用婁遠(yuǎn)來(lái)等的方法測(cè)定莽草酸含量[10]：取0.5 g莖葉組織研磨，加入1 mL濃度為0.25 mol/L的HCl，搖勻，4 ℃離心（1 200 r/min，15 min），取上層清液于4 ℃下待測(cè)。取200 μL待測(cè)液，加入 2 mL 濃度為0.01 g/mL的過(guò)碘酸溶液，混勻后加入1 mol/L NaOH和0.1 mol/L 甘氨酸，搖勻靜置 5 min 后在380 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目標(biāo)雜草的莽草酸含量。

莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法[11]：取莽草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，溶于1 mL濃度為0.25 mol/L的HCl中，分別取0、1、5、10、40、50 μL于試管中，加HCl至1 mL。使用與莽草酸含量測(cè)定相同的步驟測(cè)定380 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西本地刺莧對(duì)草甘膦的敏感性水平

由表1可知，廣西4個(gè)本地刺莧種群種子對(duì)草甘膦的相對(duì)抗性倍數(shù)在1.000～2.288之間。桂林靈川的種群對(duì)草甘膦的敏感性有所下降，桂林興安的種群對(duì)草甘膦較敏感。由表2可知，在4～6葉齡植株的抑制中濃度檢測(cè)中，桂林興安的種群ED50值最低，為2.817 g/hm2，桂林靈川的種群ED50值最高，為3.952 g/hm2。

2.2 廣西本地反枝莧對(duì)草甘膦的敏感性水平

由表3可知，廣西4個(gè)本地刺莧種群種子對(duì)草甘膦的相對(duì)抗性倍數(shù)在1.000～1.477之間。桂林興安的種群對(duì)草甘膦的敏感性有所下降，防城港港口的種群對(duì)草甘膦較敏感。由表4可知，在 4～6葉齡植株的抑制中濃度檢測(cè)中，防城港的種群ED50值最低，為3.243 g/hm2，桂林興安的種群ED50值最高，為7.916 g/hm2。

2.3 生化指標(biāo)測(cè)定法檢測(cè)廣西4個(gè)本地刺莧和反枝莧莽草酸含量

為了進(jìn)一步確認(rèn)廣西靈川等4地不同種群刺莧與反枝莧對(duì)草甘膦敏感性的變化情況，用有效成分略高于植株4～6葉齡最高ED50值的草甘膦濃度（4、8 g/hm2）分別對(duì)刺莧和反枝莧的植株莖葉進(jìn)行噴霧。由圖1、圖2可知，經(jīng)過(guò)噴藥處理之后的刺莧與反枝莧體內(nèi)的莽草酸積累量與空白對(duì)照相比明顯提高。相對(duì)較敏感的桂林興安的刺莧種群的莽草酸含量高于草甘膦敏感性較低的桂林靈川的刺莧種群;而較敏感的防城港的反枝莧種群累積的莽草酸含量高于草甘膦敏感性較低的桂林興安反枝莧種群。

3 討論

刺莧、反枝莧是我國(guó)重要的農(nóng)田莧屬雜草，在廣西分布面積較大，草甘膦作為主要的農(nóng)田除草劑，在廣西的使用非常普遍。本試驗(yàn)以廣西本地的4個(gè)刺莧種群和4個(gè)反枝莧種群為研究對(duì)象，采用目前抗藥性研究中較為常見的培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法和整株生物測(cè)定法對(duì)其草甘膦抗藥性進(jìn)行了檢測(cè)，并使用生化指標(biāo)測(cè)定法對(duì)4～6葉齡的植株體內(nèi)莽草酸積累量的變化情況進(jìn)行了測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果表明，廣西不同區(qū)域種群的刺莧和反枝莧對(duì)草甘膦的敏感性有所差別，其中桂林靈川的刺莧和桂林興安的反枝莧均表現(xiàn)出對(duì)草甘膦敏感性下降的情況。

廣西作為我國(guó)重要的農(nóng)作物產(chǎn)區(qū)與糧食進(jìn)口地區(qū)，面臨著較為復(fù)雜的農(nóng)田雜草防治情況[12]。隨著草甘膦的大量生產(chǎn)和使用，以及農(nóng)田連作、免少耕等情況的持續(xù)發(fā)生，廣西區(qū)域內(nèi)的雜草存在產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。在摸清廣西不同地域內(nèi)刺莧與反枝莧雜草對(duì)草甘膦的敏感性后，可以對(duì)區(qū)域內(nèi)作物及時(shí)采取合理的耕作栽培制度與方式，例如采取輪作、耕翻輪換、更換除草劑等措施，可以有效治理和控制抗藥性雜草的生長(zhǎng)和蔓延。由于草甘膦的作用機(jī)制是通過(guò)抑制植物體內(nèi)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），破壞植物體生長(zhǎng)[13]，因此在試驗(yàn)方法上可以通過(guò)酶活代謝檢測(cè)法或者分子水平檢測(cè)法來(lái)進(jìn)行更為精確的檢測(cè)，從而進(jìn)一步探究莧屬雜草體內(nèi)酶活性的變化情況。

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