口蹄疫抗體檢測(cè)試驗(yàn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

湯天元，趙永虎

（1.甘肅省甘州區(qū)堿灘畜牧獸醫(yī)工作站；2.甘肅省甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅張掖734000）

近年來(lái)由于活畜調(diào)運(yùn)頻繁，加大了疫病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。為了防止疫病的流行和發(fā)生，2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了2號(hào)公告，根據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《動(dòng)物防疫法》）等法律法規(guī)，為了減少畜禽長(zhǎng)距離移動(dòng)，降低動(dòng)物疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，維護(hù)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全。并規(guī)定畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)（戶(hù)）出售或者運(yùn)輸畜禽前，應(yīng)當(dāng)按照《動(dòng)物防疫法》《動(dòng)物檢疫管理辦法》規(guī)定，向當(dāng)?shù)貏?dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)申報(bào)檢疫，提交動(dòng)物檢疫申報(bào)單和相關(guān)動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)報(bào)告等申報(bào)材料。經(jīng)檢疫檢測(cè)合格的，方可調(diào)運(yùn)。各個(gè)省市區(qū)縣也出臺(tái)了相關(guān)的政策法規(guī)。還有的省市還出臺(tái)了更為嚴(yán)格的政策法規(guī)，就給獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室增加了許多責(zé)任和任務(wù)。

甘州區(qū)做為甘肅省的養(yǎng)殖大縣，牛羊數(shù)量大，牲畜調(diào)運(yùn)頻繁。這樣就增加了實(shí)驗(yàn)室人員的工作量，同時(shí)也增加了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制的抗體檢測(cè)試劑盒為例，口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒原來(lái)是2400元，10塊板，按試劑盒說(shuō)明可檢測(cè)100至200份血樣?，F(xiàn)在用改進(jìn)型口蹄病毒O型液相阻斷ELISA疫抗體檢測(cè)試劑盒是1600元，5塊板。按試劑盒說(shuō)明可檢測(cè)血樣50至100份。通過(guò)近年來(lái)試驗(yàn)室工作，改進(jìn)試驗(yàn)方法，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)步驟，我們實(shí)驗(yàn)室每塊酶標(biāo)板可做80份血樣，每個(gè)試劑盒則可做400份樣本。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制的改進(jìn)型口蹄病毒O型液相阻斷ELISA疫抗體檢測(cè)試劑盒是為例?？蓹z測(cè)50—100份血樣。以牛羊血樣檢測(cè)為例。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的樣品布局圖，有兩種布局圖，可檢測(cè)樣品50份、100份。

1.2 這種類(lèi)型的試驗(yàn)布局是為了檢測(cè)畜群的抗體效價(jià)水平能否達(dá)到保護(hù)水平。

1.3 此試驗(yàn)每份血樣的檢測(cè)成本為32-16元。

2 改進(jìn)試驗(yàn)方法，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)步驟。

2.1 同樣用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制的改進(jìn)型口蹄病毒O型液相阻斷EIISA疫抗體檢測(cè)試劑盒。

2.2 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的一次性反應(yīng)板。

如圖1所示，在每孔里面加入配制好的1：25的PBS液75ul，然后加入待檢樣品25ul.隨后依次混勻稀釋?zhuān)看翁崛?5ul依次往下稀釋三次，至26倍稀釋。提取50ul加入酶標(biāo)板。按圖2所示的布局圖加樣

圖1 96孔一次性反應(yīng)板布局圖

圖2 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)80份樣品布局圖

然后按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作完成實(shí)驗(yàn)。這樣就可以每個(gè)酶標(biāo)板就可以加樣80份血樣。

2.3 在2.2中提取50ul稀釋完成的樣本加到酶標(biāo)板，還需要加入50ul的病毒抗原，這就達(dá)到1：128了。

2.4 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 此試驗(yàn)布局適用于對(duì)外調(diào)牲畜抗體水平檢測(cè)，直接可根據(jù)結(jié)果確定群體保護(hù)率。每塊酶標(biāo)板可加樣80份。

2.6 此試驗(yàn)每份血樣的檢測(cè)成本為4元。

3 討論

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，抗體效價(jià)≥1：128，保護(hù)率達(dá)99%以上，效價(jià)≤1：16不保護(hù)，效價(jià)在1：22～90之間，50%保護(hù)，這只說(shuō)明了單個(gè)樣本的保護(hù)，不能說(shuō)明群體的保護(hù)。而改進(jìn)后重新設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法測(cè)出的則為群體中有多少樣本的保護(hù)在99%以上，就可直接算出群體保護(hù)率。這樣就節(jié)約了成本。