紅花綠絨蒿中總黃酮的含量測定及提取工藝優(yōu)化

劉明珠，李 清，暨迪軍，盧永昌,4

（1. 青海民族大學(xué) 藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2. 青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3. 青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；4. 青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810007）

紅花綠絨蒿（Meconopsis punicea Maxim）是一種傳統(tǒng)的藏藥材，藏藥名為“吾白瑪布”，為罌粟科綠絨蒿屬植物，多年生草本，主要分布于我國青海、西藏、四川、甘肅等地海拔3 400 m的高山草甸、林間。紅花綠絨蒿味甘、澀，性寒，可清熱，多用于治療血熱、肺熱、肝熱等熱癥。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，綠絨蒿屬植物具有抗疲勞、止瀉鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、保肝等作用。

紅花綠絨蒿含有黃酮類如木犀草素、槲皮素、山奈酚及其苷等化學(xué)組分。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，存在于多種植物中，不僅結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，而且數(shù)量種類繁多。此類化合物因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對不同種類細(xì)胞、哺乳動物等具有重要的生理、生化作用，是許多中草藥的有效成分。黃酮類化合物能降低腫瘤、癌癥、心血管疾?。ɡ鐚π哪X血管系統(tǒng)有益的蘆丁、橙皮苷等能夠降低血管脆性及異常通透性，可用作防治高血壓及動脈硬化的輔助治療劑）、脂質(zhì)過氧化以及骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)病率。

目前，國內(nèi)外對紅花綠絨蒿化學(xué)成分的研究較少。因此，本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化紅花綠絨蒿中總黃酮的提取條件，并采用紫外分光光度法測定紅花綠絨蒿中總黃酮的含量，以期為紅花綠絨蒿藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

722E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6，金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子分析天平；回流提取裝置。

蘆丁對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號1811260038）；其他試劑均為分析純。

紅花綠絨蒿于2019年7月采自青海省果洛州大武鎮(zhèn)，經(jīng)青海民族大學(xué)盧永昌教授鑒定確認(rèn)后，取干燥紅花綠絨蒿全草進(jìn)行粉碎后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的制備準(zhǔn)確稱量蘆丁對照品9.6 mg于50 mL容量瓶中，加60%乙醇20 mL，超聲處理使之完全溶解，以60%乙醇稀釋定容，得到質(zhì)量濃度為0.192 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取紅花綠絨蒿1.0 g并置于圓底燒瓶中，加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1.5 h，冷卻，再次稱質(zhì)量，以60%乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，做為供試品溶液備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確吸取1.2.1中制備的蘆丁對照品溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋定容。準(zhǔn)確量取不同含量對照品溶液2.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻后靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10.00 mL搖勻，加60%乙醇稀釋定容，搖勻后靜置15 min，以60%乙醇加相應(yīng)試劑作為空白，于510 nm處測定吸光度。以蘆丁對照品溶液作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為Y=0.013 2X+0.028 1（r=0.999 6），線性范圍：0.028 4～0.030 1 mg/mL。

1.2.4 提取方法對紅花綠絨蒿中總黃酮含量的影響分別準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紅花綠絨蒿，各加入60%乙醇40 mL，分別采用超聲法、熱回流法、浸提法、煎煮法、索氏提取法提取1 h，過濾后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

1.2.5 提取時間對紅花綠絨蒿中總黃酮含量的影響分別準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紅花綠絨蒿并置于圓底燒瓶中，以60%乙醇作為溶劑，準(zhǔn)確移加40 mL，分別使用熱回流法提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，過濾后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

1.2.6 料液比對總黃酮含量的影響分別準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紅花綠絨蒿并置于圓底燒瓶中，以60%乙醇作為溶劑，熱回流法提取1.5 h，設(shè)置料液比分別為1∶10、1∶ 20、1∶30、1∶ 40、1∶ 50，過濾后按 1.2.3中的方法，用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

1.2.7 乙醇濃度對紅花綠絨蒿中總黃酮含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紅花綠絨蒿并置于圓底燒瓶中，加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇各40 mL，熱回流法提取1.5 h，過濾后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

1.3 正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)

以總黃酮含量為評價指標(biāo)，通過提取方法、提取時間、料液比、乙醇含量進(jìn)行單因素考察，篩選對紅花綠絨蒿中總黃酮提取影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，然后按照所得最優(yōu)的提取方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

如圖1所示，紅花綠絨蒿中總黃酮含量用熱回流法提取效果最好，其次是煎煮法，超聲法和索氏提取法效果相似，浸提法的效果最差?？赡苁怯捎跓峄亓鞣ㄗ柚沽烁邷厮斐傻娜軇]發(fā)，使總黃酮更好的溶解于提取劑當(dāng)中。

圖1 不同提取方法對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

2.2 不同提取時間對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

如圖2所示，隨著提取時間延長，總黃酮含量也隨之增大。但當(dāng)提取時間延長至1.5 h后，總黃酮含量呈下降趨勢。因此，提取總黃酮的最佳時間為1.5 h。

圖2 不同提取時間對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

2.3 不同料液比對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

如圖3所示，紅花綠絨蒿中總黃酮含量隨料液比的增加而增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時，紅花綠絨蒿中總黃酮含量已經(jīng)很高。隨著料液比的進(jìn)一步增大，紅花綠絨蒿中總黃酮的含量僅略微上升。綜合考慮后，確定最佳料液比為1∶40。

圖3 不同料液比對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

2.4 不同乙醇含量對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

如圖4所示，隨著乙醇含量的升高，提取的紅花綠絨蒿總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇含量為60%時，得到的總黃酮含量最高。

圖4 不同乙醇含量對紅花綠絨蒿中總黃酮提取的影響

2.5 正交試驗(yàn)

如表1所示，進(jìn)行單因素考察發(fā)現(xiàn)，提取時間、料液比、乙醇含量對提取效果影響最大，對總黃酮含量影響的主次因素依次為料液比＞提取時間＞乙醇含量，從而選擇提取時間、料液比、乙醇含量進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。由表2可知，紅花綠絨蒿中總黃酮提取的最佳條件組合為A2B2C3，即提取時間為1.5 h，乙醇含量為60%，料液比為1∶40，此時所得總黃酮含量為1.06 mg/g。

表1 L9（33）因素分析

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.6 紅花綠絨蒿中總黃酮最優(yōu)提取方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表3可知，以提取時間為1.5 h，乙醇含量為60%，料液比為1∶40的條件，對紅花綠絨蒿總黃酮進(jìn)行提取，所得總黃酮含量穩(wěn)定在1.03～1.12 mg/g，說明上述條件下提取效果較好。

表3 紅花綠絨蒿中總黃酮提取方法的驗(yàn)證試驗(yàn)分析

3 結(jié)論與討論

通過單因素考察及正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響總黃酮含量的主次因素大小依次為料液比＞提取時間＞乙醇含量，最佳提取工藝條件為A2B2C3，即提取時間為1.5 h、乙醇含量為60%、料液比為1∶40，此時所得總黃酮含量為1.06 mg/g，通過驗(yàn)證試驗(yàn)也進(jìn)一步表明所選提取條件為最優(yōu)工藝。相比于其他研究中對全緣葉綠絨蒿和五脈綠絨蒿中的總黃酮含量測定，本試驗(yàn)提取的紅花綠絨蒿中總黃酮含量更高。

因此，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法與紫外可見分光光度法，對紅花綠絨蒿總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，所得總黃酮含量提高。因此，本試驗(yàn)建立的紅花綠絨蒿中總黃酮含量的提取方法簡便易行、重現(xiàn)性較好，可作為紅花綠絨蒿藥材的質(zhì)量評價依據(jù)，具有一定的參考價值。