超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 測(cè)定豬肉中腎上腺素殘留量

雙匯集團(tuán) 河南漯河 462003

腎上腺素(Epinephrine)又叫酒石酸腎上腺素、副腎堿、副腎素、鹽酸腎上腺素，分子式為C9H13O3N，分子量183.204，白色或黃白色結(jié)晶性粉末，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚，在日光下易氧化，是腎上腺分泌的一種非常重要的兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)[1]。它作為一種激素和神經(jīng)傳送體，臨床主要用于心臟驟停、支氣管哮喘、過(guò)敏性休克，是拯救瀕死的人或動(dòng)物的必備品。當(dāng)用量過(guò)大或皮下注射誤入靜脈時(shí)，可引起血壓驟升、心律失常，嚴(yán)重者可發(fā)展為腦溢血、心室顫動(dòng)。若在養(yǎng)殖過(guò)程中非法使用，其殘留對(duì)消費(fèi)者的身體健康存在安全隱患。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的針對(duì)腎上腺素的檢測(cè)方法有分光光度法[2]、高效液相色譜法[3～5]、離子色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、放射免疫和酶免疫[8]等方法，但這些方法主要集中在人體血清、尿液、藥物中的測(cè)定，豬肉中腎上腺素殘留量的測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道，因此建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的腎上腺素殘留量的檢測(cè)方法十分必要。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法、液相色譜分離條件及質(zhì)譜檢測(cè)條件，建立了豬肉中腎上腺素殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司；

PL2002型電子天平，Mettler Toledo公司；

VX-III型多管漩渦混合振蕩器，Targin公司；

MIKRO 200R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司；

H-1850R型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

食品加工機(jī)，Braun公司；

T18型高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司。

1.2 材料與試劑

腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈(質(zhì)譜純)，F(xiàn)isher公司；

甲醇(色譜純)，Merck公司；

甲酸(質(zhì)譜純)，F(xiàn)isher公司；

甲酸銨(色譜純)，Kermel公司；

其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取適量豬肉樣品絞碎，并使均質(zhì)，制成均勻樣品，-18℃以下保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用水配制成100μg/mL儲(chǔ)備液(加入適量甲酸)，-18℃冰箱避光保存。

1.3.3 中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.3.2)，用水稀釋為1μg/mL，-18℃冰箱避光保存。

1.3.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確吸取一定量中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.3.3)，用空白樣品提取液配成5、10、20、50、100、200、500ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.5 樣品前處理

稱(chēng)取2.00g±0.01g試樣于50mL聚丙烯離心管中，加入200μL 0.1mol/LEDTA溶液和10mL乙腈+甲醇(95+5)提取液，渦旋混勻，振蕩20min，5 000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。向殘?jiān)屑尤?0mL乙腈+水(15+2)溶液重復(fù)提取，合并兩次提取液，40℃下氮吹至干。用2mL2%甲酸乙腈+水(1+4)定容，加入10mL正己烷除脂，7 000r/min離心5min，吸取下層液于1.5mL離心管中，14 000r/min冷凍離心5min，過(guò)0.22um濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.6 UPLC-MS/MS分析

1.3.6.1 UPLC條件

色譜柱：Waters BEH-C18，2.1×50mm，粒徑1.7μm。

柱溫：40℃。

進(jìn)樣量：5μL。

流速：0.3mL/min。

流動(dòng)相：A，0.1%甲酸的5mmol/L甲酸銨溶液；B，乙腈，洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.6.2 MS條件

離子源：電噴霧(ESI)，正離子模式。

掃描方式：正離子掃描。

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，電離電壓3.0kv，源溫150℃，霧化氣溫度450℃，霧化氣流量900L/h，錐孔氣流量30L/h，碰撞氣為高純氬氣。

腎上腺素的定性、定量離子對(duì)，采集時(shí)間，碎裂電壓、碰撞能量如表2所示。

表2 MRM模式下腎上腺素的監(jiān)測(cè)條件

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

根據(jù)腎上腺素的化學(xué)性質(zhì)和溶解性，實(shí)驗(yàn)比較了無(wú)水乙酸鈉、氫氧化鈉甲醇溶液、0.6%氨水乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈+水(8+2)溶液、乙腈+甲醇(95+5)溶液為提取液的提取效果以及不同凈化柱(陰離子交換柱、MCX柱、PEP-2柱)的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈+甲醇(95+5)為提取液，且不經(jīng)過(guò)凈化柱，同時(shí)配制基質(zhì)標(biāo)的提取效果和回收率最佳。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

腎上腺素的極性比較強(qiáng)，在多種色譜柱上保留效果差，實(shí)驗(yàn)比較了C18、C8、T3、HILIC和Amide色譜柱對(duì)色譜分離效果和響應(yīng)值的影響，C18色譜柱測(cè)定時(shí)，腎上腺素響應(yīng)值明顯高于C8、T3、HILIC、Amide色譜柱；流動(dòng)相種類(lèi)比較了甲醇、乙腈作為有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)腎上腺素在含甲醇的有機(jī)相中峰形較差；水相比較了添加不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸及甲酸銨、乙酸銨的影響，最終選擇5mmol/L甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；同時(shí)考察了不同洗脫梯度對(duì)其保留時(shí)間和MS圖效果的影響，結(jié)果顯示，采用表1中的洗脫梯度時(shí)，峰形最好，檢測(cè)靈敏度最高。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)腎上腺素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它適合在ESI+模式下進(jìn)行離子化，其母離子為[M+H]+。試驗(yàn)采用500ng/mL的腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，采用全掃描和子離子掃描，同時(shí)通過(guò)自動(dòng)掃描和手動(dòng)掃描相結(jié)合，最終找到了母離子和子離子，并優(yōu)化了錐孔電壓和碰撞能量，得到了待測(cè)物靈敏度較高的質(zhì)譜條件。利用優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 腎上腺素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

2.4 線(xiàn)性回歸方程與定量限

按1.3.4中配成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.6中建立的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積(Y)和質(zhì)量濃度(X)做線(xiàn)性回歸，結(jié)果顯示，腎上腺素在5～500ng/mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9998)，見(jiàn)表3。通過(guò)陰性豬肉樣品加標(biāo)測(cè)定，以定量離子對(duì)的10倍信噪比為定量限，得到本方法的樣品定量限為10μg/kg。

表3 腎上腺素的線(xiàn)性方程

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)和精密度

在陰性豬肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，按表4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，腎上腺素在豬肉樣品中的加標(biāo)回收率為75%～98%，RSD為4.8%～7.9%，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)方法的要求。

表4 腎上腺素的回收率和精密度

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用建立的腎上腺素分析方法對(duì)20個(gè)豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)樣品的前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腎上腺素殘留量的方法。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、回收率高，適用于豬肉中腎上腺素的定量分析和確證，在實(shí)際檢測(cè)工作中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。