亮氨酸對(duì)大鼠肝部分切除術(shù)后肝再生的影響

林建華，洪重，周斌

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325027）

肝部分切除術(shù)是外科治療肝癌的重要手段，但大量肝實(shí)質(zhì)切除會(huì)導(dǎo)致肝功能衰竭、殘肝再生障礙，造成很高的并發(fā)癥及病死率，嚴(yán)重影響了肝癌的治療效果。如何促進(jìn)肝癌患者術(shù)后肝再生，縮短康復(fù)時(shí)間是當(dāng)前肝膽外科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。本研究用不同亮氨酸濃度的氨基酸配方對(duì)肝部分切除術(shù)后大鼠進(jìn)行添加喂養(yǎng)，探討其對(duì)殘肝再生能力的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠18只，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量250～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK（浙）2015-0009，按Higgins法切除肝左葉和中葉（約占全肝的70%），同時(shí)行胃造瘺術(shù)。術(shù)后隨機(jī)分為3組，分別經(jīng)胃造瘺管給予平衡氨基酸（8.5%樂(lè)凡命，無(wú)錫華瑞制藥有限公司BAA組）、支鏈氨基酸（杭州海力生公司，BCAA組）、亮氨酸（杭州海力生公司，Leu組），每組6 只。每日供給等氨基酸量1 g/kg，自由進(jìn)食及飲水，喂養(yǎng)7 d后處死動(dòng)物，收集肝臟標(biāo)本，處理后備測(cè)。3組氨基酸成分差異見(jiàn)表1。

表1 3組氨基酸添加量的比較（/kg體質(zhì)量）

1.2 方法

1.2.1 殘肝/體質(zhì)量比:記錄大鼠每日體質(zhì)量，7 d后處死，取出殘肝，0.9%氯化鈉溶液漂洗后稱質(zhì)量，計(jì)算殘肝/體質(zhì)量比。

1.2.2 肝細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原Ki-67和PCNA表達(dá):采用免疫組織化學(xué)二步法，檢測(cè)肝組織標(biāo)本石蠟切片，計(jì)算Ki-67和PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)。由不參與實(shí)驗(yàn)分組的病理科醫(yī)師在高倍顯微鏡視野下，計(jì)數(shù)1 000個(gè)肝細(xì)胞中陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝切除手術(shù)前后體質(zhì)量變化3組大鼠術(shù)后早期體質(zhì)量均下降，但Leu組和BCAA組在手術(shù)后期體質(zhì)量逐漸回升，接近術(shù)前狀態(tài)，而B(niǎo)AA組則在體質(zhì)量下降后處于維持狀態(tài)，見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠體質(zhì)量變化曲線

2.2 亮氨酸對(duì)肝切除大鼠殘肝/體質(zhì)量比的影響

以BAA組為對(duì)照，喂養(yǎng)7 d后Leu組的殘肝/體質(zhì)量比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BCAA組有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Leu組與BCAA組比殘肝/體質(zhì)量比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠肝部分切除術(shù)7 d后殘肝/體質(zhì)量比

2.3 亮氨酸對(duì)肝切除大鼠Ki-67和PCNA表達(dá)的影響與BAA組相比，喂養(yǎng)7 d后BCAA組和Leu組的Ki-67和PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明其殘肝細(xì)胞分裂增殖活躍，再生能力增強(qiáng)，且Leu組Ki-67和PCNA陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)較BCAA組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，可以滿足適當(dāng)?shù)氖中g(shù)切除，但過(guò)多的肝切除會(huì)導(dǎo)致肝功能失代償，影響術(shù)后恢復(fù)，甚至出現(xiàn)死亡。特別在肝硬化肝癌患者，肝再生能力已明顯受損，殘肝代償能力將直接影響預(yù)后，是手術(shù)治療成敗的關(guān)鍵。

誘導(dǎo)肝再生可有不同的途徑，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子（TNF、IL-6）、營(yíng)養(yǎng)因素等[1-2]。其中營(yíng)養(yǎng)治療簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于獲得。肝切除術(shù)后氨基酸代謝需求增加，而補(bǔ)充氨基酸可促進(jìn)肝再生，限制飲食蛋白則起抑制作用[1]。然而并非所有氨基酸是必需的，目前尚未明確的是多大的蛋白供給量以及怎樣的氨基酸成分配比對(duì)肝臟修復(fù)最為有利。

支鏈氨基酸是一組特殊氨基酸，主要在骨骼肌內(nèi)代謝，因而有利于減輕肝臟負(fù)擔(dān)。除提供營(yíng)養(yǎng)底物外，支鏈氨基酸可通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生、減少細(xì)胞凋亡、代謝生成谷氨酰胺等多種途徑利于肝再生的進(jìn)行[3-4]。近來(lái)在大鼠肝移植模型中研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸可刺激肝外骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成新的肝細(xì)胞，從而促進(jìn)肝再生[5]。支鏈氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸3種成分，研究表明，支鏈氨基酸促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用主要?dú)w功于亮氨酸[6]，而與其他2種成分無(wú)關(guān)。同樣，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[7]，在刺激產(chǎn)生肝細(xì)胞生成因子作用方面也主要依賴于亮氨酸，纈氨酸、異亮氨酸則沒(méi)有效果。所以有研究[8]指出強(qiáng)化亮氨酸的營(yíng)養(yǎng)添加比強(qiáng)化支鏈氨基酸可能更加有效，作者前期研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)[9]。

圖3 3組大鼠肝部分切除術(shù)7 d后肝細(xì)胞Ki-67、PCNA免疫組織化學(xué)染色（×200）及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

本研究結(jié)果顯示，肝部分切除大鼠術(shù)后給予亮氨酸添加喂養(yǎng)，殘肝/體質(zhì)量比、肝細(xì)胞的PCNA和Ki-67 陽(yáng)性計(jì)數(shù)均較平衡氨基酸組有顯著增加，說(shuō)明肝細(xì)胞分裂增殖活躍，再生能力增強(qiáng)，且作用跟亮氨酸的喂養(yǎng)量成正比。亮氨酸作為一種特殊的氨基酸，不僅提供營(yíng)養(yǎng)底物，更可能是一種營(yíng)養(yǎng)信號(hào)因子，通過(guò)激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。目前認(rèn)為亮氨酸的作用主要與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶途徑活化有關(guān)[6-7，10-11]，通過(guò)進(jìn)一步磷酸化其下游的4EBP1和S6K1等信號(hào)分子在蛋白翻譯起始階段起作用，而mTOR信號(hào)通路激活則可能通過(guò)多種方式促進(jìn)肝細(xì)胞的再生[1，7，12-13]。

我們認(rèn)為，較之平衡氨基酸，亮氨酸更有利于肝部分切除大鼠術(shù)后殘肝的再生，且作用優(yōu)于支鏈氨基酸。但過(guò)高的亮氨酸喂養(yǎng)是否會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不良影響以及亮氨酸促進(jìn)肝再生的具體作用機(jī)制等問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。