麥冬多糖的提取分離及含量測定

何鋒　陸小蘭　滕寶松

【摘? 要】目的：將傳統(tǒng)提取工藝與膜分離技術(shù)聯(lián)用對麥冬多糖進行分離純化，并考察其多糖含量。方法：采用L₉（4³）正交試驗對麥冬多糖的提取工藝進行優(yōu)化;采用不同分子量級別的超濾膜對麥冬多糖進行精制分離研究。結(jié)果：麥冬多糖最佳提取條件為95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脫除率高。檢測了超濾膜分級研究所得的各組分多糖含量。結(jié)論：本研究優(yōu)選的工藝在技術(shù)上是合理的、可行的，合適的超濾膜可以將麥冬多糖進行很好的分級純化。

【關(guān)鍵詞】麥冬;膜分離;多糖

【中圖分類號】R914;R96?? ???【文獻標識碼】A?? ???【文章編號】1004-7484（2020）09-0296-02

Extraction， separation and content determination of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus

【Abstract】Objective：The polysaccharide of Ophiopogon japonicus was separated and purified by the combination of traditional extraction technology and membrane separation technology， and the content of polysaccharide was investigated.MethodsL9 （4³） orthogonal test was used to optimize the extraction process of Ophiopogon japonicus polysaccharide. The purification and separation of Polysaccharide from Ophiopogon japonicus was studied by ultrafiltration membrane with different molecular weight.ResultThe best extraction condition of Ophiopogon japonicus polysaccharide was 95 °C， 2 times， 2 hours each time. High protein removal rate of Sevage method. The content of polysaccharide in each component of ultrafiltration membrane was determined.ConclusionThe optimal technology of this study is reasonable and feasible， and the suitable ultrafiltration membrane can carry out a good classification and purification of Ophiopogon japonicus polysaccharide.

【Key words】Ophiopogon japonicus; Membrane separation; polysaccharides

中藥麥冬（Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.）為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物干燥塊根，味苦、微苦、性微寒。入心、肺、胃經(jīng)。有養(yǎng)陰生津，潤肺清心^[1]的功效，是中醫(yī)藥寶庫中的珍品。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，麥冬的化學(xué)成分比較豐富，含有多糖、甾體皂苷、高異黃酮類、氨基酸等。具有多種藥理作用，能夠增加機體耐缺氧能力;降血糖，促進胰島細胞的恢復(fù);提高機體免疫能力等作用^[2]。

膜分離技術(shù)是一項新型的高效分離技術(shù)，它是在分子水平上，不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時，選擇性分離的技術(shù)，根據(jù)膜上小孔的實際大小，可將其分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等^[3]。目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及環(huán)保水處理等各個領(lǐng)域^[4-5]。膜分離技術(shù)以選擇性透過膜為分離遞質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在一定電位差、濃度差或壓力差時，原料一側(cè)的組分就會選擇性地透過膜，從而實現(xiàn)大、小分子的分離，達到有效成分凈化濃縮的目的^[6-8]。

超濾技術(shù)是膜分離技術(shù)的一種，是以0.1～0.5 MPa的壓力差為推動力，利用多孔膜的攔截能力，以物理截留的方式，將溶液中不同大小的物質(zhì)顆粒分開，從而達到純化和濃縮、篩分溶液中不同組分的目的 ^[9]。 超濾主要用于從液相物質(zhì)中分離大分子化合物（蛋白質(zhì)，核酸聚合物，多糖，天然膠等），膠體分散液（粘土，顏料，礦物料，孔液粒子，微生物），乳液（潤滑脂-洗滌劑以及油-水乳液）。其操作靜壓差一般為0.1-0.5MPa，被分離組分的直徑大約為0.01-0.1μm，一般為分子量范圍0.5KDa-1000KDa的大分子和膠體粒子^[10-11]。

1儀器與材料

UV-2600/2700紫外可見分光光度計，日本島津;W201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司;LGJ-10D冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;TGL-20B離心機，上海安亭科學(xué)儀器;LNG-HFM-10實驗室膜分離設(shè)備，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司;1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa超濾膜，上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司;1KDa透析袋，上海源葉生物科技有限公司。

麥冬干燥塊根購自綿陽市川誠豪宇麥冬開發(fā)有限責(zé)任公司;95%乙醇、濃硫酸、氯仿和正丁醇購自上海振興化工一廠;苯酚購自江蘇永華精細化學(xué)品有限公司;葡萄糖購自北京華爾博科技有限公司;Tris購自上海希美生物科技有限公司;Lowry蛋白定量試劑盒購自上海荔達生物科技有限公司;檸檬酸購自上?？婆d生物科技有限公司;檸檬酸鈉購自上海佳倫生物科技有限公司;水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1多糖含量的測定

1）制作標準曲線：準確稱取葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL，各以水補至2mL，然后加入6%苯酚1mL，靜止10min，然后加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫放置20min后于490nm測光密度，以2mL水按同樣操作為空白，以橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為光密度值，得標準曲線Y = 0.2904X+ 0.0271， R²=0.9953，線性范圍為0.025～0.150mg/mL。

2）樣品含量測定：吸取樣品液1mL（相當(dāng)于40μg左右的多糖），加水1mL，然后加入6%苯酚1mL，靜止10min，然后加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫放置20min后于490nm測光密度，以標準曲線計算多糖含量。

2.2蛋白含量的測定

1）制作標準曲線：準確配置濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液0.5mL，加入試劑A （含Cu²⁺的堿性試劑）2.5mL，混勻后室溫放置10min。各管加入試劑B（酚試劑即磷鎢酸-磷鉬酸不用稀釋，直接使用）0.25mL，每加一管必須立即混勻，室溫放置30min，然后在650nm波長處測定光吸收，以橫坐標為蛋白濃度，縱坐標為光密度值，得標準曲線Y =13.866X+ 0.0668，R²=0.9943。

2）樣品含量測定：各管加入待測溶液0.5mL，空白對照用0.5mL生理鹽水或蒸餾水來替代待測溶液。各管加入試劑A 2.5mL，混勻后室溫放置10min，各管加入試劑B 0.25mL。

2.3多糖的提取

2.3.1工藝流程

麥冬塊根干品用粉碎機粉碎，稱取10g麥冬粉碎后樣品，以蒸餾水作為溶劑，按一定浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)進行浸提，冷卻濾過，合并濾液，離心棄沉淀得上清液，上清液經(jīng)濃縮后，加入4倍量95%乙醇進行沉淀，靜置過夜。離心所得沉淀加適量水溶解，Sevage試劑（氯仿-正丁醇=4：1）除蛋白3次，將脫蛋白后粗多糖用膜分離技術(shù)進行純化精制。

2.3.2單因素試驗

參照“2.3.1”項工藝流程，每次稱取10g麥冬粉碎后樣品，考察浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)對麥冬多糖提取率的影響。

2.3.2.1浸提溫度對多糖提取率的影響

在浸提時間2h，提取2次的條件下，考察不同浸提溫度55°C、75°C、95°C對麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為2.78%、5.43%、7.67%?？梢钥闯鲭S著溫度的升高，多糖提取率也隨之提高。

2.3.2.2浸提時間對多糖提取率的影響

在浸提溫度95°C，提取2次的條件下，考察不同浸提時間1h、2h、3h對麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為3.77%、7.65%、8.23%。可以看出隨著浸提時間的延長，多糖提取率不斷升高，但當(dāng)浸提時間大于2h，多糖提取率增加幅度降低。

2.3.2.3浸提次數(shù)對多糖提取率的影響

在浸提溫度95°C，浸提時間2.0h條件下，按照浸提次數(shù)為1、2、3次對麥冬多糖提取率的影響，結(jié)果分別為4.31%、7.63%、7.95%?？梢钥闯鲭S著浸提次數(shù)的增加，多糖提取率不斷升高，當(dāng)浸提次數(shù)大于2次時，提取率升高幅度不大。

2.3.3正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標，進行3因素3水平L₉（4³）正交試驗，考察浸提溫度（A）、浸提時間（B）和浸提次數(shù)（C）對多糖提取率的影響，實驗設(shè)計和結(jié)果見表1。由表1可知，3個因素對麥冬多糖提取率的影響依次為浸提次數(shù)>浸提溫度>浸提時間。最優(yōu)工藝為A₃B₂C₂，即浸提溫度95°C，浸提時間2h，浸提次數(shù)2次。

2.4脫蛋白實驗

Sevage法：取3g多糖粗粉溶解成25mL多糖水溶液，按多糖水溶液-氯仿-正丁醇=25：24：1的比例充分混合后萃取3次，得上清液，濃縮冷凍干燥后得脫蛋白后多糖。用Lowry法檢測后證明脫蛋白前多糖粗粉蛋白含量為17.86%，脫蛋白后蛋白含量為1.47%，脫除率高達91.8%。

2.5麥冬多糖超濾膜分離研究

超濾膜分離的關(guān)鍵在于膜型號的選擇。本實驗選擇1000KDa、500KDa、100KDa、30KDa分子量級別的超濾膜將麥冬多糖進行分級純化。

將麥冬脫蛋白后的粗多糖配成質(zhì)量濃度為0.05g/mL水溶液1L，先經(jīng)1000KDa超濾膜超濾分離，1L料液結(jié)束后用純化水頂洗0.5L，得1.4L透過液和0.1L濃縮液（F1），將透過液全部進行500KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗0.7L，得2.0L透過液和0.2L濃縮液（F2），然后將透過液全部進行100KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗1L，得2.7L透過液和0.3L濃縮液（F3），然后將透過液全部進行30KDa超濾膜超濾分離，并加水頂洗1.5L，得0.5L濃縮液（F4）和3.7L透過液，取1L透過液用1KDa透析袋透析除鹽并旋蒸濃縮得組分F5。將F1-F5組分分別冷凍干燥，稱定質(zhì)量，計算得率（）。用苯酚硫酸法檢測超濾分級得到的各組分多糖含量。結(jié)果見表2。

3討論

麥冬自古以來就為人們所熟知，有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩等功效。本實驗將麥冬多糖傳統(tǒng)水提醇沉工藝與超濾膜分離技術(shù)相結(jié)合，對麥冬多糖進行了精制分離。結(jié)果表明麥冬多糖水提工藝最佳條件為提取溫度95°C，提取2次，每次2h。Sevage法蛋白脫除率高，而且操作方法簡單、穩(wěn)定，能保證麥冬多糖的穩(wěn)定提取。

綜上所述，相比于傳統(tǒng)工藝，超濾膜分離技術(shù)在多糖的分離純化中具有獨特的優(yōu)勢。在運作過程中無相變、無化學(xué)反應(yīng)可在最大程度上保留多糖活性。但膜分離過程中膜組件和膜清洗繁瑣等問題還需要進一步研究優(yōu)化。

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