N，N-二甲基甲酰胺通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路減輕順鉑引起急性臟損傷的研究

文麗波

【摘? 要】N，N-二甲基甲酰胺（DMF）具有抗炎和抗氧化的能力。我們旨在探討DMF是否可以通過(guò)NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）途徑調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷。

【關(guān)鍵詞】N，N-二甲基甲酰胺;Nrf2信號(hào)通路;急性腎損傷

【中圖分類號(hào)】R459.7?? ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?? ???【文章編號(hào)】1004-7484（2020）09-0096-01

順鉑是廣泛的高效抗腫瘤藥物。但是，順鉑的腎毒性也會(huì)在治療過(guò)程中引起急性腎損傷（AKI）。因此，減輕順鉑引起的腎毒性的研究已得到充分研究^【1】。近年來(lái)，NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中的作用引起了廣泛關(guān)注。Nrf2是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要核轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)證實(shí)，Nrf215-18可調(diào)節(jié)200多種內(nèi)源保護(hù)性基因。

N，N-二甲基甲酰胺對(duì)由毒物和缺血引起的器官損傷的發(fā)生和發(fā)展的影響已得到公認(rèn)。

動(dòng)物

將共30只體重180-220g的SD大鼠飼養(yǎng)在溫度可控制的房間中，該房間可自由獲取食物和水。對(duì)照組大鼠灌胃蒸餾水（0.01mL/g）10天。DDP組的大鼠用蒸餾水（0.01mL/g）注射7天，然后在第7天注射順鉑（25mg/kg）。之后，將大鼠繼續(xù)用蒸餾水再給藥3天。DMF組的大鼠在頭7天用等劑量蒸餾水處理。

順鉑治療后，再給予DMF 3天。最后一次給藥后一小時(shí)，從眼眶靜脈取血，麻醉后處死大鼠。觀察并記錄在整個(gè)給藥期間大鼠的體重和日?；顒?dòng)的變化。

腎功能評(píng)估

每次在胃內(nèi)給藥之前記錄大鼠的體重。處死大鼠后，立即收獲新鮮的雙側(cè)腎臟組織并稱重。腎臟指數(shù)=腎臟重量/體重。將總共2 mL血液樣品以3500 g/min的速度離心30分鐘。用肌氨酸氧化酶法測(cè)定血清肌酐（Cr）水平，用脲酶法測(cè)定尿素氮（BUN）水平。

組織學(xué)檢查

將每組的腎組織切成冠狀切片，用10%甲醛固定并包埋石蠟。然后將組織用蘇木精和曙紅染色。通過(guò)半定量檢查腎小管壞死評(píng)估組織學(xué)變化。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下：0=無(wú)損壞，1=10%，2=11%至25%，3=26%至45%，4=46%至75%，5=>76%。觀察到每個(gè)樣品的五個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域。

TUNEL分析

根據(jù)原位DNA末端轉(zhuǎn)移酶（TUNEL）測(cè)定法（ApopTag加過(guò)氧化物酶原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒;Chemicon，Millipore，Billerica，MA，USA）檢測(cè)腎臟切片中的細(xì)胞凋亡。5微米厚的石蠟切片用于TUNEL染色，并用甲基綠復(fù)染。在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)視野中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。

生化測(cè)量

在腎臟組織的顏色從紅色變?yōu)榘咨?，將腎臟迅速移出并置于液氮中。將部分組織攪勻并儲(chǔ)存在-80°C的冰箱中。根據(jù)相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書測(cè)量MDA，T-AOC，CAT，GSH，SOD和ROS的含量。

免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋的組織脫蠟并水合后，添加50μL抗大鼠PCNA（1：100）并在室溫下孵育1小時(shí)。用PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗滌3次后，加入40-50μL相應(yīng)的二抗并在室溫下再孵育1小時(shí)。加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（R&D Systems，明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯，美國(guó)），使顏色顯影5-10分鐘。用去離子水沖洗殘留的DAB。最后將組織脫水，密封并在顯微鏡下觀察。

蛋白質(zhì)印跡

向腎臟組織中添加裂解緩沖液，并在冰上振搖30分鐘。在4℃下以14，000g/min離心15分鐘后，分離總蛋白。通過(guò)二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Pierce，Rockford，IL，USA）計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。提取的蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠中分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)馬薩諸塞州Billerica的Millipore）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。一抗是Nrf2，血紅素加氧酶-1（HO-1），NAD（P）H，奎寧氧化還原酶1（NQO-1）。二抗是抗小鼠和抗兔抗體。

統(tǒng)計(jì)分析

t檢驗(yàn)用于比較連續(xù)變量。分類變量使用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率方法進(jìn)行分析。進(jìn)行Kaplan-Meier法評(píng)估患者的生存時(shí)間，采用Log-rank檢驗(yàn)比較不同曲線之間的差異。SPSS 22.0（統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品和服務(wù)解決方案）用于數(shù)據(jù)分析（IBM，Armonk，NY，美國(guó)）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x[–]±s）。p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

DMF預(yù)處理改善了順鉑誘導(dǎo)的腎損傷小鼠的腎功能。

DDP組的體重和腎臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組（p<0.05），表明成功建立了順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷模型。與DDP組相比，用20 mg/kg DMF治療后大鼠體重和腎臟指數(shù)顯著改善（p<0.05）。此外，腎臟功能相關(guān)指標(biāo)的定量分析顯示，DDP組和DMF組的血清Cr和BUN含量高于對(duì)照組（p<0.05）。然而，DMF組的BUN和Cr水平仍顯著高于對(duì)照組。

DMF保留腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)并減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)

對(duì)照組腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)正常。DDP組觀察到管狀小管腔增大和扁平上皮。此外DDP組的腎臟組織中出現(xiàn)了顆粒變性和核固縮癥的紊亂細(xì)胞。DDP組也有明顯的腎小球收縮，間質(zhì)增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DMF組的腎臟損傷小于DDP組。DDP組和DMF組的腎小管損傷評(píng)分均高于對(duì)照組（p<0.05）。

DMF減少順鉑誘導(dǎo)的腎損傷后腎小管細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)的細(xì)胞殖。

DDP組腎臟的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量高于假手術(shù)組（p<0.05，）。但是，與DDP組相比，DMF組腎臟的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（p<0.05）。此外，我們對(duì)腎臟切片進(jìn)行了PCNA免疫染色，以評(píng)估DMF是否會(huì)影響腎小管上皮細(xì)胞的增殖。DMF組的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于DDP組（p<0.05）。

DMF通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力降低了ROS的產(chǎn)生和組織損傷

我們的數(shù)據(jù)表明，DDP可以顯著損害腎臟組織的抗氧化能力并刺激ROS的產(chǎn)生。施用DMF可有效恢復(fù)腎臟損傷組織勻漿（包括SOD，GSH，SOD，CAT和T-AOC）中抗氧化劑標(biāo)記物的水平。DMF還減少了腎臟組織中的ROS生成。此外，DMF組腎臟組織中脂質(zhì)過(guò)氧化指數(shù)MDA也顯著低于DDP組。

為了探索DMF在順鉑引起的腎臟損傷中的保護(hù)機(jī)制，我們進(jìn)一步從腎臟組織中提取了總蛋白。與對(duì)照組和DDP組相比，DMF組的Nrf2表達(dá)顯著增加。

蛋白印跡結(jié)果還表明，與對(duì)照組和DDP組相比，DMF組中Nrf2的核轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)。Nrf2核轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)也增加了DMF組中HO-1和NQO-1的水平。

參考文獻(xiàn)

[1]Manohar S，Leung N.Cisplatin nephrotoxicity：a re-view of the literature.J Nephrol 2018;31：15-25.

依托課題：

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)局指令項(xiàng)目（SFGG-201902）

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)局指令項(xiàng)目（SFGG-201410）