薄荷素油鼻黏膜保濕微乳的制備及其黏膜黏附性和纖毛毒性研究

荀波娜 畢青玲 謝茵 李萍 楊麗 畢小平

摘 要 目的：制備薄荷素油鼻黏膜保濕微乳，并對(duì)其黏膜黏附性和纖毛毒性進(jìn)行考察。方法：以聚氧乙烯氫化蓖麻油為乳化劑制備薄荷素油鼻黏膜保濕微乳，基于綜合評(píng)分以正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化微乳的制備工藝；對(duì)所制微乳進(jìn)行表征并采用氣相色譜法測定薄荷醇含量；通過測定蟾蜍在體纖毛傳輸速率評(píng)價(jià)其黏膜黏附性，測定蟾蜍離體纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間以評(píng)價(jià)其纖毛毒性。結(jié)果：自制微乳的優(yōu)化制備工藝為先將薄荷素油與乳化劑分散，再加入無水乙醇、食用甘油、蒸餾水混合后，于1 200 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌2 h。3批自制微乳中薄荷醇的平均含量為2.682、2.507、2.496 mg/mL，RSD為2.89%（n=3）。自制微乳高、中、低劑量組（以薄荷醇計(jì)2.561、0.256、0.128 mg/mL）蟾蜍在體上顎纖毛傳輸速率分別為（0.65±0.01）、（0.78±0.03）、（0.92±0.04）cm/min，顯著低于生理鹽水組和復(fù)方薄荷腦滴鼻液組（P<0.05）；蟾蜍離體上顎纖毛運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為（206.7±4.9）、（226.0±13.5）、（269.3±12.9）min，顯著長于去氧膽酸鈉組（P<0.05）。結(jié)論：自制微乳的制備工藝可行、質(zhì)量可控，其黏膜黏附性較好，無纖毛毒性。

關(guān)鍵詞 薄荷素油；鼻黏膜；保濕；微乳；工藝優(yōu)化；黏附性；纖毛毒性

Preparation of Peppermint Oil Moisturizing Microemulsion for Nasal Mucosa and Study on Its Mucosal Adhesion and Cilia Toxicity

XUN Bona1，BI Qingling2，XIE Yin1，LI Ping1，YANG Li1，BI Xiaoping1（1. School of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2. Dept. of Otolaryngology， China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare the Peppermint oil moisturizing microemulsion for nasal mucosa and survey its mucosal adhesion and cilia toxicity. METHODS： The polyoxyethylene hydrogenated castor oil was used as emulsifier to prepare the Peppermint oil moisturizing microemulsion for nasal mucosa， and the preparation technology was optimized on the basis of comprehensive score by orthogonal design. The microemulsion was characterized and the menthol content was determined by GC. The mucosal adhesion was evaluated by measuring the transport rate by cilia in vivo， and the cilia toxicity of microemulsion was evaluated by measuring the sustained movement time of cilia in vitro. RESULTS： The optimal preparation technology of self-made microemulsion was to firstly disperse the peppermint oil and the emulsifier， then add anhydrous ethanol， edible glycerin and distilled water， and stir at 1 200 r/min for 2 h. The average contents of menthol in the three batches of the microemulsion were 2.682， 2.507 and 2.496 mg/mL （RSD=2.89%，n=3）， respectively. The cilia transport rates in vivo were （0.65±0.01）， （0.78±0.03）and （0.92±0.04） cm/min in high-dose， medium-dose， and low-dose groups of self-made microemulsion （2.561， 0.256， 0.128 mg/mL of menthol） respectively， which were significantly lower than normal saline group and compound menthol nasal droups （P<0.05）. The cilia movement time in vitro were（206.7±4.9）， （226.0±13.5）， （269.3±12.9）min， which were significantly longer than sodium deoxycholate group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The preparation technology of self-made microemulsion is easy-to-handle and controllable in quality. The prepared microemulsion shows good mucosal adhesion without cilia toxicity.

2.3 微乳制備工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)前期單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以攪拌速度（A，r/min）、攪拌時(shí)間（B，h）和加料方式（C）為影響因素，3因素3水平設(shè)計(jì)見表1（注：加料方式中a法是指將油分散于乳化劑中，再加入其他成分；b法是指將油分散于助乳化劑中，再加入其他成分；c法是指直接將各成分混勻）。

2.3.2 多指標(biāo)綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)微乳制備工藝 根據(jù)正交設(shè)計(jì)的L9（33）方案進(jìn)行試驗(yàn)，采用“2.2”項(xiàng)下的粒徑、PDI、Zeta電位、濁度等指標(biāo)，運(yùn)用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法[12]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和評(píng)價(jià)分析。綜合評(píng)分計(jì)算公式[13]：

2.3.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照“2.3.2”項(xiàng)下優(yōu)化的制備工藝，平行制備3批保濕微乳（批號(hào)：20180720-1、20180720- 2、20180720- 3），按前述方法測定各項(xiàng)指標(biāo)后進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見表3。

2.4 微乳中薄荷醇的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：TP-FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min的速度升至100 ℃，保持1 min，再以12 ℃/min的速度升至180 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；檢測器溫度：250 ℃；載氣：氮?dú)猓兌龋?9.99%）；流速：3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10 ∶ 1。

2.4.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液。精密稱取薄荷醇對(duì)照品73.20 mg，置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為3.660 mg/mL的薄荷醇對(duì)照品溶液。②內(nèi)標(biāo)溶液。取水楊酸乙酯2.024 g，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.101 2 g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。③供試品溶液。精密量取自制微乳（批號(hào)：20180729-1）2 mL，加入無水硫酸鈉1.0 g，搖勻，超聲（功率：50 W，頻率：40 kHz）處理20 min，50 ℃水浴，約20 min后油水分層破乳；取上層，加甲醇溶解，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，加內(nèi)標(biāo)溶液（水楊酸乙酯）100 μL，用甲醇定容至3 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。④空白對(duì)照溶液。精密量取空白微乳2 mL，按本項(xiàng)下“③供試品溶液”方法處理，即得。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果顯示，色譜峰峰形對(duì)稱，薄荷醇峰與樣品中的各組分達(dá)到基線分離，其他組分對(duì)待測組分的測定無干擾；以薄荷醇峰計(jì)理論板數(shù)為62 643，薄荷醇與相鄰兩峰分離度分別為3.189和12.80。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取薄荷醇對(duì)照品溶液75、150、225、300、375、750、1 125 μL，均精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再分別精密加入甲醇1 375、1 300、1 225、1 150、1 075、700、325 μL至1.5 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以薄荷醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、薄荷醇峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得薄荷醇回歸方程為y=0.482 6x-0.018 1（r=0.999 5）。結(jié)果表明，薄荷醇檢測質(zhì)量濃度在0.183～2.745 mg/mL范圍內(nèi)與其峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 定量限與檢測限考察 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，以甲醇逐步稀釋，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測限為0.048 8 mg/mL；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限為0.162 7 mg/mL。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.4.4”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度（1.830、0.915、0.366 mg/mL）的薄荷醇對(duì)照品溶液各適量，于同日內(nèi)早、中、晚3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取樣，并連續(xù)3 d于同一時(shí)間點(diǎn)分別取樣，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，高、中、低質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD分別為2.85%、2.21%、1.34%（n=3），日間精密度RSD分別為2.50%、2.96%、1.19%（n=3）。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20180729-1）適量，分別在室溫下放置0、0.5、1、2、4、6、10、12、24 h時(shí)取樣，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，平行測定3次。結(jié)果，薄荷醇峰面積的RSD為2.99%（n=9），說明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取自制微乳（批號(hào)：20180729-1）適量，共6份，按“2.4.2”項(xiàng)下“③供試品溶液”方法配制溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，平行測定3次。結(jié)果，樣品中薄荷醇的平均含量為2.535 mg/mL，RSD為2.25%（n=6），說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取同一批次（批號(hào)：20180729-1）的自制微乳1.0 mL，按“2.4.2”項(xiàng)下“③供試品溶液”方法對(duì)微乳進(jìn)行前處理制備得樣品溶液，分別加入高、中、低濃度（120%、100%、80%）的薄荷醇對(duì)照品溶液，加甲醇定容至3 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，加樣回收率在94.44%～104.14%之間，平均加樣回收率為98.73%，RSD為3.26%（n=9），說明該方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見表4。

2.4.10 樣品含量測定 取3批自制微乳（批號(hào)：20180729-1、20180729-2、20180729-3）各適量，共6份，按“2.4.2”項(xiàng)下“③供試品溶液”方法配制溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，3批自制微乳中薄荷油的含量（以薄荷醇計(jì)）分別為2.682、2.507、2.496 mg/mL，RSD為2.89%（n=3），說明自制微乳的質(zhì)量穩(wěn)定、可控。

2.5 微乳對(duì)蟾蜍黏膜的黏附性試驗(yàn)

取健康中華大蟾蜍30只，隨機(jī)分為陰性組、陽性組和自制微乳高、中、低劑量組，每組6只。探針破壞蟾蜍脊髓后使其仰臥固定，止血鉗拉伸口腔裸上顎，陰性組蟾蜍上腭部位給予生理鹽水，陽性組蟾蜍上腭部位給予復(fù)方薄荷腦滴鼻液，自制微乳高、中、低劑量組蟾蜍上腭部位給予自制微乳（以薄荷醇計(jì)2.561、0.256、0.128 mg/mL），給藥體積均為0.5 mL，使上腭部位完全被浸沒。5 min后，吸干受試液，用鑷子將約0.1～0.3 cm長的鉛筆芯置于蟾蜍上腭兩眼窩前緣間的黏膜上，觀察鉛筆芯沿黏膜纖毛緩慢向咽部移動(dòng)的情況，用秒表記錄鉛筆芯移動(dòng)1 cm所需時(shí)間作為纖毛傳輸時(shí)間，計(jì)算黏膜纖毛傳輸速率及相對(duì)傳輸速率（相對(duì)傳輸速率=受試組纖毛傳輸速率/陰性組纖毛傳輸速率）[14-17]，纖毛傳輸速率越慢或相對(duì)傳輸速率越小，則受試物可較長滯留在鼻腔內(nèi)部，黏膜黏附性越強(qiáng)，以此評(píng)價(jià)不同受試物的黏膜黏附性差異，結(jié)果見表5。

由表5可見，自制微乳高、中、低劑量組的相對(duì)傳輸速率是陰性組的0.55、0.66、0.78倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且劑量越大，其對(duì)黏膜的黏附性越強(qiáng)（即傳輸速率越低）。自制微乳各劑量組與陽性組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而陽性組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明，自制微乳在黏膜表面的滯留時(shí)間明顯延長，具有較強(qiáng)的黏膜黏附性，且優(yōu)于復(fù)方薄荷腦滴鼻液。

2.6 微乳對(duì)蟾蜍纖毛的毒性試驗(yàn)

取健康中華大蟾蜍36只，隨機(jī)分為陰性組、陽性組、毒性組和自制微乳高、中、低劑量組，每組6只。按照“2.5”項(xiàng)下“探針破壞蟾蜍脊髓……，使上腭部位完全被浸沒”同法操作新增毒性組給予1%去氧膽酸溶液），30 min后，用生理鹽水洗凈藥物，用眼科手術(shù)剪分離蟾蜍兩眼之間的黏膜（3 mm×3 mm），用生理鹽水洗凈血塊及雜物，黏膜面向上平鋪于載玻片上，于黏膜表面滴加0.2 mL生理鹽水，輕輕蓋上蓋玻片，于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛運(yùn)動(dòng)情況，記錄從給藥至纖毛停止運(yùn)動(dòng)所持續(xù)的時(shí)間，即纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間（PVD）；以各給藥組的PVD除以陰性組的PVD，計(jì)算纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)百分率（PPV）[14-17]，詳見表6。

由表6可見，各組的PVD及PPV由高到低排序均為自制微乳低劑量組>陰性組>自制微乳中劑量組>陽性組>自制微乳高劑量組>毒性組。PPV越長或PVD越大，受試物對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)的影響越小，對(duì)纖毛毒性也越小。與毒性組比較，其余各組的PVD均顯著延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中自制微乳高、中、低劑量組表現(xiàn)出劑量依賴趨勢，劑量越低，毒性越小，自制微乳低劑量組纖毛毒性最小且優(yōu)于陰性組；與陰性組比較，自制微乳各劑量組及陽性組的PVD差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。顯微鏡下可見，毒性組纖毛很快停止擺動(dòng)，排列雜亂，受損嚴(yán)重，部分脫落，出現(xiàn)裸露基部，對(duì)蟾蜍纖毛毒性最大；陰性組纖毛清晰完整，運(yùn)動(dòng)活躍，整體呈波浪狀擺動(dòng)；陽性組和自制微乳各劑量組纖毛較清晰完整，運(yùn)動(dòng)活躍，排列較整齊，無脫落等異?，F(xiàn)象。這提示除毒性組外，其他各組藥物對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)影響相對(duì)較小，表明自制微乳基本無纖毛毒性。

3 討論

本試驗(yàn)自制微乳是以薄荷素油為油相和主藥、CO- 40為乳化劑、無水乙醇為助乳化劑、甘油為保濕劑制備而成的O/W型鼻黏膜保濕微乳。其中，乙醇作為助乳化劑，既增溶又防腐；甘油作為理想的保濕劑，又兼有助乳化劑的增溶作用。

復(fù)方薄荷腦滴鼻液是經(jīng)典常規(guī)使用的鼻黏膜保濕制劑[18]，故選用其作為陽性組藥物，用于考察自制微乳的黏膜黏附性。去氧膽酸鈉是公認(rèn)的具有纖毛毒性的藥物[16]，以其為毒性組藥物可驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物纖毛的敏感性。

本課題組提出并制備了基于薄荷素油的鼻黏膜保濕微乳，且通過蟾蜍在體黏膜黏附性試驗(yàn)和蟾蜍離體纖毛毒性試驗(yàn)，對(duì)其黏膜黏附性和纖毛毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，自制微乳具有較強(qiáng)的黏膜黏附性，且優(yōu)于復(fù)方薄荷腦滴鼻液，且劑量越大，黏膜黏附性越強(qiáng)；在試驗(yàn)劑量下，自制微乳無纖毛毒性作用。

本自制微乳能使黏膜有效保濕，可能是由于：（1）自制微乳本身的小尺寸效應(yīng)[19]以及黏附效應(yīng)，使其可以較長時(shí)間地滯留在纖毛縫隙中，不易被纖毛快速傳輸出去，有助于鼻腔黏膜保濕作用的發(fā)揮；同時(shí)微乳載體良好的滲透性，有助于水通道蛋白雙向轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油等物質(zhì)進(jìn)出皮膚[20]，有效改善鼻腔內(nèi)部微環(huán)境缺水的狀態(tài)，快速恢復(fù)原有的生理功能；（2）被納米化的薄荷素油因其親脂性可附著于脂質(zhì)層，形成局部封閉的薄膜屏障，使角質(zhì)細(xì)胞維持水合狀態(tài)，從而發(fā)揮保濕作用。但該自制微乳的具體保濕機(jī)制究竟如何，還有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-12-03 修回日期：2019-05-09）

（編輯：余慶華）