西咪替丁對(duì)低劑量率照射比格犬肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究

王慶蓉 何穎 趙憶寧 沈先榮 劉玉明 李珂嫻 羅群 陳偉 侯登勇

摘 要 目的：研究西咪替丁對(duì)低劑量率照射比格犬肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法：將健康雄性比格犬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性藥物組（香菇多糖，21.33 mg/kg）和西咪替丁低、中、高劑量組（5.33、10.67、21.33 mg/kg），每組4只。除正常對(duì)照組外，其余各組比格犬均予60Co-γ射線（劑量率：0.040 8 mGy/min）累積照射23 d，各給藥組于每日照射前口服相應(yīng)藥物1次。停止照射24 h后，采用TUNEL法檢測(cè)各組比格犬肝細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比；采用免疫組化法檢測(cè)其肝組織中凋亡相關(guān)蛋白[Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、p53]的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組比格犬肝組織中凋亡細(xì)胞以及Bax、Caspase-3、p53陽性細(xì)胞均明顯增加，凋亡細(xì)胞百分比以及Bax、Caspase-3、p53蛋白表達(dá)水平均顯著升高；Bcl-2陽性細(xì)胞明顯減少，其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型對(duì)照組比較，各給藥組比格犬肝組織中上述陽性細(xì)胞均有不同程度的變化，其中各給藥組凋亡細(xì)胞百分比和p53蛋白表達(dá)水平，陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組Bax蛋白表達(dá)水平以及西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低；西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高；且西咪替丁中、高劑量組凋亡細(xì)胞百分比以及西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著低于陽性對(duì)照組，西咪替丁低劑量組p53蛋白表達(dá)水平顯著高于陽性藥物組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：西咪替丁可抑制低劑量率照射所致的比格犬肝細(xì)胞凋亡，對(duì)其具有一定的輻射保護(hù)作用。這種作用可能與上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 西咪替丁；低劑量率輻射；肝臟；肝細(xì)胞凋亡；凋亡相關(guān)蛋白；比格犬；防輻射；機(jī)制

Effects of Cimetidine on Low Dose Rate Irradiation-induced Liver Cell Apoptosis in Beagle Dogs and Its Mechanism

WANG Qingrong，HE Ying，ZHAO Yining，SHEN Xianrong，LIU Yuming，LI Kexian，LUO Qun，CHEN Wei，HOU Dengyong（Dept. of Radiation Protection Medicine， Naval Medical Research Institute， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of cimetidine on low dose rate irradiation-induced liver cell apoptosis in Beagle dogs. METHODS： Healthy male Beagle dogs were randomly divided into normal control group， model control group， positive drug group （lentinan， 21.33 mg/kg） and cimetidine low-dose， medium-dose and high-dose groups （5.33， 10.67， 21.33 mg/kg）， with 4 Beagle dogs each. Except for normal control group， other groups were given 60Co-γ accumulative irradiation （dosage rate： 0.040 8 mGy/min） for 23 d； the medication groups were given relevant medicine orally before irradiation， once a day. Twenty-four hours after stopping irradiation， TUNEL method was used to detect the apoptosis of liver cells in Beagle dogs. The percentage of apoptotic cells was calculated. The expression level of apoptosis-related proteins （Bax， Bcl-2， Caspase-3， p53） in liver tissue was detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with normal control group， apoptotic cells and Bax， Caspase-3， p53 positive cells were increased significantly in liver tissue of Beagle dogs in model control group； the percentage of apoptotic cells， protein expression levels of Bax， Caspase-3 and p53 were increased significantly； Bcl-2 positive cells were decreased significantly， and its protein expression level was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model control group， above positive cells of liver tissue in Beagle dogs were changed to different extents in medication groups； the percentage of apoptotic cells and protein expression levels of p53 in medication groups， protein expression levels of Bax in positive drug group， cimetidine low-dose and high-dose groups as well as protein expression levels of Caspase-3 in cimetidine groups were decreased significantly； protein expression levels of Bcl-2 were increased significantly in cimetidine groups. The percentage of apoptotic cells in cimetidine medium-dose and high-dose groups as well as protein expression levels of Caspase-3 in cimetidine groups were all lower than positive control group. Protein expression level of p53 in cimetidine low-dose group was significantly higher than positive drug group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Cimetidine can inhibit the low dose rate irradiation-induced apoptosis of liver cells in Beagle dogs， and certainly protect liver cells against irradiation. The mechanism of it may be associated with up-regulating the protein expression of Bcl-2 and down-regulating the protein expression of Bax， Caspase-3 and p53 in liver cells.

KEYWORDS Cimetidine； Low dose rate irradiation； Liver； Liver cell apoptosis； Apoptosis-related proteins； Beagle dogs； Irradiation-resistance； Mechanism

隨著核能應(yīng)用（涉及醫(yī)學(xué)、軍事、工業(yè)領(lǐng)域）的多樣化、普遍化，人們受到輻射損傷的風(fēng)險(xiǎn)也隨之升高。低劑量電離輻射（Low-dose radiation，LDR）可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來改變多種基因和蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生不同于大劑量照射且復(fù)雜多樣的生物效應(yīng)[1-3]。近年來，LDR的健康效應(yīng)受到了放射生物學(xué)家的極大關(guān)注，但由于其致機(jī)體損傷的作用機(jī)制尚存有爭(zhēng)議，故現(xiàn)有研究不多。西咪替丁是第一個(gè)用于臨床的H2受體拮抗藥，主要用于治療胃及十二直腸潰瘍、上消化道出血等疾病。隨著藥理學(xué)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)該藥具有許多不同于其他H2受體拮抗藥的新用途，如輻射防護(hù)作用[4-6]。本課題組前期研究了西咪替丁對(duì)LDR小鼠、大鼠和犬的防護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)LDR模型動(dòng)物的造血系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)均具有較好的防護(hù)效果[7-9]。在此基礎(chǔ)上，本研究以對(duì)放射較敏感的肝臟為對(duì)象，重點(diǎn)觀察了西咪替丁對(duì)低劑量率照射（即長(zhǎng)期累積劑量超過100 mGy，但劑量率低于5 mGy/h，更接近職業(yè)人群實(shí)際受輻射情況[10]）致比格犬肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期為闡明該藥防護(hù)LDR的作用機(jī)制、研發(fā)新型抗LDR藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；XSP-C204型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；5418R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；TB-214型精密電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

西咪替丁片（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1509241，規(guī)格：0.2 g）；香菇多糖片（陽性對(duì)照，浙江普洛康裕天然藥物有限公司，批號(hào)：150401，規(guī)格：基片重0.1 g）；兔源Bax多克隆抗體（武漢博奧森生物科技有限公司，批號(hào)：bs-0127R）；兔源p53多克隆抗體（美國(guó)OmnimAbs公司，批號(hào)：om267038）；兔源胱天蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、兔源Bcl-2多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為Ab4051、Ab117115）；山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗、乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復(fù)液（pH 9.0）、山羊血清、蛋白酶K工作液、Harris蘇木精染色液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為GB23303、G1203、G1208、G1205、G1004）；TUNEL檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)：11684817910）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（丹麥Dako公司，批號(hào)：K5007）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

普通級(jí)比格犬24只，雄性，體質(zhì)量8～10 kg，由上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0005]。

2 方法

2.1 分組

所有比格犬均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性藥物組[香菇多糖，21.33 mg/kg；劑量參考犬體質(zhì)量（12 kg）并按照該藥臨床成人劑量（800 mg/d）換算而得（換算系數(shù)為0.32，下同）]以及西咪替丁低、中、高劑量組[5.33、10.67、21.33 mg/kg，劑量參考犬體質(zhì)量（12 kg）并分別按照該藥臨床成人劑量（200、400、800 mg/d）換算而得][11]，每組4只。實(shí)驗(yàn)過程中，所有比格犬均單籠飼養(yǎng)，自由飲水，并喂以專用膨化飼料，每日2次。

2.2 照射與給藥

除正常對(duì)照組外，其余各組比格犬均予60Co-γ射線累積照射，劑量率為0.040 8 mGy/min，每日照射18 h，連續(xù)照射23 d（最后一天照射9 h）。各給藥組比格犬均于每日照射前給予相應(yīng)藥物1次（將犬固定，用開口器將犬的數(shù)顆門齒固定好，將藥物放至比格犬舌根部，迅速閉合口腔，使犬自然吞咽服下藥物）；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組比格犬不作任何處理。

2.3 樣本采集

當(dāng)累積照射劑量接近1.0 Gy時(shí)（即連續(xù)照射23 d后），停止照射。于停止照射24 h后，靜脈注射3%戊巴比妥鈉對(duì)各組比格犬進(jìn)行麻醉，解剖，取出其肝組織適量（約1 cm×1 cm×2 cm），置于10%甲醛溶液中固定2～3 d后，行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度約為3 ?m），備用。

2.4 肝細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)比格犬肝細(xì)胞的凋亡情況。取“2.3”項(xiàng)下肝組織石蠟切片，脫蠟后置于水中，滴加蛋白酶K工作液適量，于37 ℃下孵育25 min；以pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每次5 min；滴加TUNEL檢測(cè)試劑盒內(nèi)試劑1和試劑2的混合溶液[即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）-三磷酸脫氧尿苷（dUTP），體積比為1 ∶ 9]，于37 ℃下孵育2 h；以PBS洗滌3次，每次5 min，將樣本轉(zhuǎn)移至3%H2O2中，于室溫下避光孵育15 min，以PBS洗滌3次，每次5 min；經(jīng)DAB顯色后，用水沖洗終止顯色；以Harris蘇木精染色液輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察（凋亡陽性細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒）。每只犬每張切片隨機(jī)挑選6個(gè)視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比（凋亡細(xì)胞百分比=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)比格犬肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53蛋白的表達(dá)情況。取“2.3”項(xiàng)下肝組織石蠟切片，脫蠟后置于水中，以EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，隨后加入3%H2O2以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用10%山羊血清封閉30 min，分別滴加Bcl-2、Bax、Caspase-3、p53多克隆抗體（稀釋度均為1 ∶ 50），4 ℃孵育過夜；滴加HRP標(biāo)記二抗（1 ∶ 1），常溫孵育50 min；以DAB顯色，Harris蘇木精染色液輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察（p53陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，其余蛋白陽性細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒）。每只犬每張切片隨機(jī)挑選6個(gè)視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0軟件對(duì)染色陽性區(qū)域進(jìn)行分析，計(jì)算陽性細(xì)胞的累積光密度值（IOD）以表示凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組比格犬肝組織中偶見凋亡細(xì)胞；停止照射后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組比格犬肝組織中凋亡細(xì)胞明顯增加，其凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，各給藥組比格犬肝組織中凋亡細(xì)胞均有所減少，其凋亡細(xì)胞百分比均顯著降低，且西咪替丁中、高劑量組顯著低于陽性藥物組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見圖1、表1（圖中，“ []”所指為普通細(xì)胞，呈藍(lán)色；“ ”所指為相應(yīng)凋亡細(xì)胞，呈棕黃色；下同）。

3.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組比格犬肝組織中可見不同程度的Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53蛋白陽性染色；停止照射后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組比格犬肝組織中Bax、Caspase-3、p53陽性細(xì)胞明顯增多、其蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2陽性細(xì)胞明顯減少、其蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，各給藥組比格犬肝組織中凋亡相關(guān)蛋白的陽性染色情況均有不同程度的改變，其中陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組比格犬肝組織中Bax蛋白表達(dá)水平，西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平以及各給藥組p53蛋白表達(dá)水平均顯著降低，西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高；且西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著低于陽性藥物組，西咪替丁低劑量組p53蛋白表達(dá)水平顯著高于陽性藥物組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2～圖5、表1。

4 討論

體內(nèi)外研究結(jié)果表明，西咪替丁具有較好的輻射防護(hù)作用，可能與其清除自由基、增加抗氧化酶表達(dá)及活性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、保護(hù)造血功能等有關(guān)[5-6，12-13]，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。2002年，日本學(xué)者Kojima Y等[5]通過離體人外周血淋巴細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)了西咪替丁對(duì)大劑量X射線誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞微核發(fā)生和細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。細(xì)胞凋亡受多基因共同調(diào)控，如Bcl-2家族、Caspase家族、p53等。有研究表明，輻射可激活Caspase-3，并同時(shí)誘導(dǎo)Bax編碼基因的表達(dá)；p53參與輻射誘導(dǎo)的DNA損傷所致的凋亡過程，且其可被Bcl-2編碼基因抑制[14-15]。已有研究表明，抗氧化劑能保護(hù)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有明顯的輻射防護(hù)效應(yīng)[16]。西咪替丁具有較強(qiáng)的清除自由基、增強(qiáng)抗氧化酶表達(dá)及活性的作用，對(duì)大劑量X射線誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[8，17-18]。隨著核能應(yīng)用的日益廣泛，人們受到LDR（尤其是低劑量率照射）影響的概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大劑量電離輻射，但目前有關(guān)LDR損傷防護(hù)藥物的研究卻十分有限：Mozdarani H等[19]報(bào)道了西咪替丁對(duì)低劑量快中子輻射損傷的防護(hù)作用；Jiang DW等[20]報(bào)道了西咪替丁對(duì)長(zhǎng)期低劑量率中子和γ射線混合照射致大鼠輻射損傷的防護(hù)作用。因此，為進(jìn)一步挖掘相關(guān)輻射防護(hù)藥物，有必要深入開展西咪替丁對(duì)LDR（尤其是低劑量率照射）防護(hù)作用的研究。

由于多糖具有較好的抗氧化、提高免疫力的作用，故近年來其抗輻射的作用也日益受到學(xué)者的關(guān)注。香菇多糖片為臨床常用藥物，主要用于慢性乙型遷延性肝炎和消化道腫瘤放化療的輔助治療，已有文獻(xiàn)報(bào)道了其對(duì)輻射損傷小鼠的防護(hù)作用[21]，因此本研究以香菇多糖片作為陽性對(duì)照藥物。肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，也是對(duì)放射較敏感的器官之一，其放射敏感性弱于骨髓、淋巴組織、小腸、性腺、胚胎和腎[22]。本研究以低劑量照射比格犬肝臟為靶器官，以其肝細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況為指標(biāo)，初步探討了西咪替丁的抗輻射作用及可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，以低劑量率連續(xù)照射23 d、累積劑量近1.0 Gy時(shí)，比格犬肝組織中可見明顯的凋亡細(xì)胞，其凋亡細(xì)胞百分比較正常對(duì)照組顯著升高。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)低劑量率照射后，比格犬肝組織中Bax、Caspase-3、p53陽性染色細(xì)胞明顯增多，其蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著升高；Bcl-2陽性染色細(xì)胞明顯減少，其蛋白表達(dá)水平顯著降低。這表明低劑量率（0.040 8 mGy/min）60Co-γ射線累積照射近1.0 Gy可導(dǎo)致比格犬肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成一定程度的輻射損傷，且這種損傷與上調(diào)Bax、Caspase-3、p53蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，這與已有文獻(xiàn)結(jié)果[23]基本相符。經(jīng)西咪替丁預(yù)處理后，各給藥組比格犬肝組織中凋亡細(xì)胞均有不同程度的減少，其凋亡細(xì)胞百分比均顯著降低。免疫組化結(jié)果顯示，各給藥組比格犬肝組織中凋亡蛋白的表達(dá)均有不同程度的改變，其中陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組比格犬肝組織中Bax蛋白表達(dá)水平，西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平以及各給藥組p53蛋白表達(dá)水平均顯著降低；西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高。這提示西咪替丁能有效抑制低劑量率照射所致的肝細(xì)胞凋亡，并減少Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道的西咪替丁可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[24-26]相矛盾。筆者推測(cè)這可能與西咪替丁對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞存在雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究探討。此外本研究結(jié)果還顯示，西咪替丁中、高劑量組比格犬凋亡細(xì)胞百分比以及西咪替丁各劑量組比格犬肝組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著低于陽性藥物組，而西咪替丁低劑量組比格犬肝組織中p53蛋白表達(dá)水平顯著高于陽性藥物組。這提示高劑量西咪替丁對(duì)低劑量率照射比格犬肝細(xì)胞凋亡的抑制作用可能強(qiáng)于陽性對(duì)照藥物，而中、高劑量西咪替丁對(duì)Bax、Bcl-2、p53等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用則與陽性藥物相當(dāng)。

綜上所述，西咪替丁可抑制低劑量率照射所致的比格犬肝細(xì)胞凋亡，對(duì)其具有一定的輻射保護(hù)作用。這種作用可能與上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達(dá)有關(guān)。但西咪替丁對(duì)LDR致?lián)p傷的保護(hù)作用分子機(jī)制及其抗凋亡的信號(hào)通路還有待后續(xù)深入研究。

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