高效液相色譜法測(cè)定人纖維蛋白條件的探索

于濤 孫麗麗

摘?要：本文探索了高效液相色譜法檢測(cè)人纖維蛋白含量的色譜條件，在固定波長(zhǎng)下，配置不同比例的磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選出最適合的流動(dòng)相配比;選定最佳組合條件并為開展進(jìn)一步分析提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;人纖維蛋白

Exploration of determination of human fibrin conditions

by high performance liquid chromatography

Yu?Tao*SunLiLi

Changchun Medical College?JiLinChangchun?130031

Abstract：In this paper，the chromatographic conditions for the determination of human fibrin content by high performance liquid chromatography were explored.The relative detection results of different ratios of phosphate buffer flow were compared at a fixed wavelength to select the most suitable mobile phase ratio.The combination conditions provide a theoretical basis for further analysis.

Key words：High performance liquid chromatography;human fibrin

人纖維蛋白原（簡(jiǎn)稱纖原），是血漿蛋白的主要成分，也是凝血系統(tǒng)中的“中心”蛋白質(zhì)，具有止血功能，除直接參與凝血過(guò)程后期階段，還介導(dǎo)血小板聚集、影響血液黏度。

《中國(guó)藥典》表明蛋白含量測(cè)定可分柱前衍生和柱后衍生兩大類，人纖維蛋白含量測(cè)定屬于柱前衍生法，衍生試劑具有毒性，且分析時(shí)間長(zhǎng)（超過(guò)30min），本實(shí)驗(yàn)采用Shodex KW-800系列凝膠色譜柱KW-802.5進(jìn)行分析，設(shè)定幾組不同條件的流動(dòng)相配比進(jìn)行測(cè)定，篩選出最佳的實(shí)驗(yàn)條件，建立一種低成本高效率測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

人纖維蛋白原為BIOSHARP公司產(chǎn)品，規(guī)格：100mg/支，Exp：2017/03。

1.2 主要試劑及儀器

磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，乙腈（分析純），凝膠色譜柱Shodex KW-802.5，島津紫外檢測(cè)器。

1.3 流動(dòng)相及樣品溶液的制備

流動(dòng)相采用乙腈-純水（1：1）、乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（分別配置比例4∶6、1∶1、6∶4），稱取磷酸二氫鈉9.5g，磷酸氫二鈉125g，至于500mL容量瓶中，超純水溶解并定容，另取500mL乙腈與其混合，用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾。

1.4 樣品處理

精密量取樣品溶液1mL，加入相對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相乙腈-磷酸鹽緩沖液和乙腈-純水溶液99mL，充分混勻，靜止30min，進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，離心5min，取上層清液進(jìn)行測(cè)定。

1.5 色譜條件

采用凝膠色譜柱Shodex KW-802.5（5μm，8*300 mm）;流速1mL/min;波長(zhǎng)設(shè)定為205nm、215nm、230nm、280nm;柱溫40℃;采用島津LC-15C色譜工作站;進(jìn)樣量20μL。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

紫外吸收波長(zhǎng)不變，分別在不同配比的流動(dòng)相條件下分析蛋白分子保留時(shí)間及色譜峰強(qiáng)度，篩選最適合的實(shí)驗(yàn)條件。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同流動(dòng)相配比下檢測(cè)結(jié)果（紫外吸收波長(zhǎng)設(shè)定為215nm）。（1）流動(dòng)相配比為乙腈：水=1∶1，結(jié)果見圖1。

通過(guò)譜圖可看出，沒有磷酸鹽緩沖液保護(hù)，蛋白分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，色譜峰保留時(shí)間和對(duì)稱性也都不理想，達(dá)不到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的目的，并且此種情況與乙腈-純水的比例無(wú)關(guān)，蛋白質(zhì)氨基酸高效液相分析中不適合采用此種流動(dòng)相配置。

（2）以乙腈-磷酸鹽緩沖液做流動(dòng)相，配比分別為4∶6、1∶1、6∶4，檢測(cè)結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

通過(guò)圖譜可看出，在乙腈比例低于磷酸鹽緩沖液時(shí)色譜峰保留時(shí)間推遲較大，色譜峰與其它兩種流動(dòng)相檢測(cè)結(jié)果相比差別較大，初步判斷為水相比例過(guò)高，出現(xiàn)色譜峰形拖尾嚴(yán)重，并出現(xiàn)色譜峰消失現(xiàn)象;在乙腈高于磷酸鹽緩沖液的流動(dòng)相檢測(cè)結(jié)果得出：雖然峰形和對(duì)稱性較好，但是蛋白檢測(cè)比例整體降低，乙腈含量的增加沒有增強(qiáng)蛋白分子的洗脫效果，保留時(shí)間變化不大。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)流動(dòng)相配比條件的摸索，確定在215nm波長(zhǎng)下，乙腈-磷酸鹽緩沖液比例在1∶1配比下有最佳實(shí)驗(yàn)效果，當(dāng)增加乙腈比例為7∶3時(shí)，溶液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，無(wú)法做流動(dòng)相使用。若降低磷酸鹽含量，則出現(xiàn)蛋白洗脫含量降低，色譜峰對(duì)稱性及分離度降低的情況，綜合其它測(cè)試結(jié)果考慮建議保持磷酸鹽含量不變。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)方法條件的摸索，得到最佳實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，有良好的重復(fù)性，可直接用于人纖維蛋白含量測(cè)定，無(wú)需使用含有毒性的衍生劑，且該方法節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間、試劑成本，提高了效率，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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