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    苯胺降解菌的分離及其降解特性

    2019-10-18 09:24:13王浩權(quán)朱興華胡惠允孟祥敏崔岱宗
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年15期

    王浩權(quán) 朱興華 胡惠允 孟祥敏 崔岱宗

    摘要:從吉林省吉林市某化工廠附近的土壤中分離到1株可在好氧條件下高效降解苯胺的菌株。經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn),該菌株與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有較近的親緣關(guān)系,基于此,將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5,該菌株可在溫度為20~40 ℃、pH值為6~9及鹽度為1%~3%的條件下對(duì)苯胺進(jìn)行有效降解;菌株D5可對(duì)高濃度苯胺進(jìn)行降解,可在52 h內(nèi)降解90%以上1 000 mg/L的苯胺;此外,菌株D5可對(duì)反復(fù)添加的苯胺連續(xù)降解,以上的特性為其日后應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理創(chuàng)造了良好的條件。

    關(guān)鍵詞:苯胺;假單胞菌屬;降解特性

    中圖分類號(hào): X172

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2019)15-0287-04

    苯胺(Aniline)是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的一種重要化工原料,是農(nóng)藥、染料、塑料及藥物生產(chǎn)中的重要原料及中間體,廣泛存在于印染、制藥、橡膠及其他諸多化工行業(yè)的生產(chǎn)廢水中[1]。近年來,越來越多的苯胺廢水被排放到自然水體和土壤中。苯胺毒性大且在自然環(huán)境中化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,很難降解。苯胺具有嚴(yán)重的致癌、致畸、致突變的“三致”作用,并可以造成人或動(dòng)物心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及其他臟器的損害,嚴(yán)重危害接觸者的健康[2-3]?;诖耍绹?guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(Environmental Protection Agency,簡(jiǎn)稱EPA)已將苯胺列為優(yōu)先控制的污染物,我國(guó)及其他各國(guó)也將其列為嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康的污染物[4]。

    在自然環(huán)境下,苯胺主要是在各類微生物尤其是好氧細(xì)菌的作用下進(jìn)行生物降解,其降解速率受微生物活性、環(huán)境條件(如溶氧量、溫度、pH值)等因素的顯著影響[5]。近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)苯胺的微生物降解開展了大量的研究工作,越來越多的苯胺降解細(xì)菌得到分離和純化,主要為不動(dòng)桿菌屬 (Acinectobacter)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、紅球菌屬 (Rhodococcus)、戴爾福特菌屬 (Delftia)細(xì)菌[6-8]。此外,許多學(xué)者對(duì)苯胺降解相關(guān)酶基因的克隆表達(dá)及序列分析、苯胺降解的代謝途徑等進(jìn)行了研究[9-12]。

    雖然對(duì)苯胺生物降解的研究已取得了一定進(jìn)展,但菌體對(duì)苯胺降解速度較慢、污染物耐受條件較差等缺點(diǎn)仍然極大地制約了降解菌株的工業(yè)化應(yīng)用。因此,篩選苯胺降解能力更高、抗逆性更強(qiáng)的降解菌株仍然是目前研究工作的重點(diǎn)。

    在本研究中,筆者從長(zhǎng)期受苯胺廢水污染的環(huán)境中分離出1株可在好氧條件下高效降解苯胺的細(xì)菌,并探討不同理化因素對(duì)菌株降解苯胺的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本研究中用于篩選苯胺降解細(xì)菌的環(huán)境樣品取自吉林省吉林市某染料生產(chǎn)廠附近的土壤。

    富集培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基):胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g,加水至1 L,調(diào)pH值至7.0。

    苯胺降解培養(yǎng)基:葡萄糖2 g、NH4Cl 1 g、Na2HPO4 2 g、NaH2PO4 1 g、MgSO4 0.2 g,加水至1 L,調(diào)pH值至7.0。進(jìn)行降解試驗(yàn)時(shí)添加一定濃度的苯胺。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 苯胺降解菌株的篩選 稱取1 g環(huán)境樣品,放入裝有50 mL滅菌水的100 mL三角瓶中,將三角瓶置于搖床上在 100 r/min 下振蕩1 h,將振蕩后的懸濁液靜置,上清液即為供接種的樣品。

    取1 mL樣品加入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。采用相同方法接種1代培養(yǎng)菌液1 mL至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng),使樣品中的好氧菌群得到活化。

    向降解培養(yǎng)基中加入苯胺,使培養(yǎng)基中苯胺的終濃度達(dá)到200 mg/L,按2%(V/V)接種量接種第2次活化的混合菌液至苯胺降解培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。采用此方法對(duì)混合菌液進(jìn)行連續(xù)篩選培養(yǎng),觀察苯胺的降解效果,初步確定混合菌液中是否存在能夠高效降解苯胺的菌株。

    將篩選后的混合菌群在固體苯胺降解培養(yǎng)基(苯胺濃度200 mg/L)上進(jìn)行劃線分離,并對(duì)長(zhǎng)出的單菌落重新進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

    將篩選出的菌株轉(zhuǎn)接種于LB液體培養(yǎng)基中,并向其中加入20%甘油作為保護(hù)劑,于-40 ℃冰箱中保藏。

    1.2.2 苯胺濃度的測(cè)定 對(duì)苯胺濃度的測(cè)定采用萘乙二胺偶氮光度法[13]。

    1.2.3 降解菌株的鑒定 采用16S rDNA序列分析方法對(duì)分離出的苯胺降解細(xì)菌進(jìn)行鑒定。菌株基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[14]進(jìn)行提取。以提取的菌株DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物27F:5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′、1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸 2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。將經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD 18-T質(zhì)粒上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)中,取50 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上,在37 ℃下培養(yǎng)16 h,挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件拼接及人工校對(duì)后,通過BLAST程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并下載相關(guān)序列,采用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行多序列比對(duì),Phylip 3.67軟件對(duì)序列進(jìn)行親緣性及系統(tǒng)發(fā)育分析。

    1.2.4 菌體生長(zhǎng)曲線及苯胺降解曲線的測(cè)定 將菌種按2%(V/V)接種量接種到含有200 mg/L苯胺的苯胺降解培養(yǎng)基中,于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每3 h取樣1次測(cè)菌體在600 nm處的吸光值(以液體篩選培養(yǎng)基為空白對(duì)照)。

    取2 mL菌液在8 000 r/min下離心10 min后測(cè)定上清液中的苯胺殘余含量,并計(jì)算苯胺的降解率。

    1.3 不同理化因素對(duì)菌株降解苯胺的影響

    1.3.1 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響 將經(jīng)活化后的菌株按2%(V/V)接種量接種至無機(jī)鹽降解培養(yǎng)基(含有 200 mg/L 苯胺)中,分別置于15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)16 h后,取3 mL菌液測(cè)定菌株生長(zhǎng)量(D600 nm) 及苯胺的降解率。

    1.3.2 pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響 將經(jīng)活化后的菌株按2%(V/V)接種量接種至無機(jī)鹽降解培養(yǎng)基(含有 200 mg/L 苯胺)中,培養(yǎng)基的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10,于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)12 h后,取3 mL菌液測(cè)定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

    1.3.3 鹽度對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響 向降解培養(yǎng)基中添加NaCl,使其終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%,將經(jīng)活化后的菌株按2%(V/V)接種量接種至無機(jī)鹽降解培養(yǎng)基(含有200 mg/L苯胺)中,于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)12 h后,取3 mL菌液測(cè)定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

    1.4 苯胺濃度對(duì)降解率的影響

    在無機(jī)鹽降解培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的苯胺(400、600、800、1 000 mg/L),將經(jīng)活化后的菌株按2%(V/V)接種量接種至上述含有不同濃度苯胺的培養(yǎng)基中,于35 ℃好氧條件下培養(yǎng),記錄不同濃度苯胺的降解時(shí)間及降解率。

    1.5 連續(xù)投加苯胺對(duì)降解率的影響

    將經(jīng)活化后的菌株按2%(V/V)接種量接種至含有 200 mg/L 苯胺的培養(yǎng)基中,于35 ℃好氧條件下培養(yǎng),待培養(yǎng)基中的苯胺降解完全后,再向培養(yǎng)基中投加苯胺,使培養(yǎng)基中苯胺濃度重新達(dá)到200 mg/L,當(dāng)?shù)?次投加的苯胺降解后,繼續(xù)向培養(yǎng)基中投加苯胺。重復(fù)以上步驟,測(cè)定每次投加苯胺的降解率及降解時(shí)間。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苯胺高效降解菌株的分離與鑒定

    環(huán)境樣品經(jīng)過富集后,在含有苯胺的降解培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選,經(jīng)反復(fù)平板劃線純化,得到1株苯胺降解細(xì)菌,命名為D5。對(duì)菌株D5的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序后,結(jié)合美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。測(cè)序結(jié)果表明,PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1 500 bp。將序列進(jìn)行Blast比對(duì)后,下載相關(guān)序列,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,基于各菌株的16S rDNA序列利用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,選取枯草芽孢桿菌為外群,大于50%的自展值標(biāo)記于各分枝上,結(jié)果如圖1所示。本研究篩選出的苯胺降解菌株與假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 聚為一枝,且與黃單胞菌屬 (Xanthomonas) 菌株親緣關(guān)系較近?;诖?,筆者認(rèn)為本研究所分離到的降解菌株屬于銅綠假單胞菌,將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5。

    2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線及苯胺的降解曲線

    將菌株D5以2%(V/V)接種量接入含有200 mg/L苯胺的無機(jī)鹽降解培養(yǎng)基中,測(cè)定菌體濃度和菌液中苯胺的殘留量,從而檢測(cè)菌株D5在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況和對(duì)苯胺的降解情況。試驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明,菌株D5可在降解培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。在前3 h對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)后,菌株D5在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì),16 h后菌體的D600 nm值可達(dá)到約1.65,由此可見200 mg/L苯胺對(duì)菌株D5的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用。在菌株生長(zhǎng)的同時(shí),培養(yǎng)體系中的苯胺濃度迅速下降,15 h內(nèi)苯胺的降解率即達(dá)到90%以上,至18 h培養(yǎng)基中的苯胺已被完全降解。表明菌株D5是1株可在好氧條件下對(duì)苯胺進(jìn)行有效降解的菌株。

    2.3 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響

    本研究采用菌液濁度(D600 nm)來間接反映菌株的生長(zhǎng)速率。從圖3可以看出,菌株D5在35 ℃下的生長(zhǎng)速率及對(duì)苯胺的降解速率均達(dá)到最大值。在此溫度下,菌株對(duì)200 mg/L

    苯胺的16 h降解率達(dá)到99%。當(dāng)溫度在20~40 ℃之間時(shí),菌株D5均保持著對(duì)苯胺較高的降解能力。如在40 ℃下,菌株經(jīng)16 h的培養(yǎng)后仍可降解約70%的苯胺;然而,當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),菌株的生長(zhǎng)速率急劇下降,苯胺的降解率也明顯降低。

    溫度過高或過低均會(huì)降低菌株的生長(zhǎng)速率并抑制細(xì)菌內(nèi)相關(guān)酶的活性,從而造成苯胺降解速率的下降。值得注意地是,菌株D5在低溫下具有一定的苯胺降解能力,當(dāng)溫度僅為15 ℃時(shí),菌株D5仍可在16 h內(nèi)降解約32%的苯胺。東北三省冬季較寒冷,污水管道內(nèi)的水溫只有10~15 ℃,低溫嚴(yán)重影響了活性污泥或降解菌株對(duì)污染物的降解速率。因此,篩選出在低溫條件下仍可降解苯胺的菌株具有較為重要的現(xiàn)實(shí)意義。

    2.4 pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響

    從圖4可以看出,菌株對(duì)苯胺降解的最適pH值為7.0,在該pH值條件下,菌株可以在16 h內(nèi)降解約99%的苯胺。當(dāng)降解培養(yǎng)基的pH值維持在6~9范圍內(nèi)時(shí),pH值的變化并未對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和苯胺的降解造成明顯影響,在該pH值范圍內(nèi),經(jīng)過16 h的培養(yǎng),菌株D5可對(duì)苯胺維持85%以上的降解率。菌株D5有一定的耐堿性,在降解體系pH值為10時(shí),菌株仍可在16 h內(nèi)降解約70%的苯胺。

    與溫度變化對(duì)細(xì)菌降解能力的影響相似,pH值過高或過低均會(huì)對(duì)苯胺的降解產(chǎn)生負(fù)面影響,其原因是過堿和過酸條件可能會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和與苯胺降解有關(guān)酶的活性。

    2.5 鹽度對(duì)菌體生長(zhǎng)及苯胺降解的影響

    從圖5可以看出,當(dāng)降解體系中的鹽度逐漸增大時(shí),菌株D5的生長(zhǎng)速率逐漸減小;與之相對(duì)應(yīng),苯胺的降解速率也逐漸減小。然而, 菌株D5仍具備一定的耐鹽性,當(dāng)降解體系中

    的鹽濃度為1%~3%時(shí),菌株在16 h內(nèi)可對(duì)苯胺維持80%以上的降解率,即使當(dāng)降解體系內(nèi)的鹽度達(dá)到5%時(shí),菌株仍可在16 h內(nèi)降解約32%的苯胺。

    2.6 苯胺濃度對(duì)降解率的影響

    從表1可以看出,菌株D5可有效降解不同濃度的苯胺。當(dāng)苯胺的濃度為400、600、800、1 000 mg/L時(shí),菌株D5可分別在24、30、40、52 h內(nèi)達(dá)到90%以上的苯胺降解率。表明菌株D5可在較高濃度的苯胺環(huán)境中生長(zhǎng)并高效降解苯胺,說明菌株D5對(duì)高濃度的苯胺廢水具有極大的降解潛力。

    2.7 連續(xù)投加苯胺對(duì)降解率的影響

    從圖6可以看出,菌株D5可在16 h內(nèi)對(duì)降解體系中第1次添加的苯胺基本完全降解(降解率大于98%)。在第2與第3次添加苯胺后,菌株D5均可在16 h內(nèi)降解90%以上的苯胺。在第4次添加苯胺后,菌株對(duì)苯胺的降解速率稍有變慢,培養(yǎng)16 h后約有80%的苯胺被降解。表明菌株D5有能力對(duì)連續(xù)添加的苯胺進(jìn)行降解。

    苯胺降解變緩可能是由于降解體系中營(yíng)養(yǎng)成分逐漸耗盡,剩余營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)不能滿足菌體的生長(zhǎng)和代謝。另外,降解體系中的pH值、溶氧量等理化因素也越來越不適合菌體的生長(zhǎng)。

    3 結(jié)論與討論

    本研究在化工廠附近的土壤中分離到1株可以在好氧條件下對(duì)苯胺進(jìn)行降解的菌株D5。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后發(fā)現(xiàn),該菌株與銅綠假單胞菌有較近的親緣關(guān)系。之前已經(jīng)有報(bào)道證明,假單胞菌屬細(xì)菌可在好氧條件下高效地降解苯胺類化合物,如Oliver等從活性污泥中分離到的假單胞菌屬細(xì)菌可以降解濃度為100 mg/L以下的二苯胺[15];Bengtson等在工業(yè)廢水中篩選出的假單胞菌屬細(xì)菌可有效降解低濃度的氯代苯胺,然而,當(dāng)降解底物濃度過大時(shí),菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制[16]。假單胞菌屬經(jīng)菌細(xì)胞內(nèi)含有苯胺雙加氧酶(aniline dioxygenase),可將苯胺氧化為鄰苯二酚,鄰苯二酚通過鄰苯二酚2,3-雙加氧酶 (catechol-2,3-dioxygenase) 繼續(xù)氧化,最后生成丙酮酸和乙醛,進(jìn)入三羧酸循環(huán),徹底得到礦化。假單胞菌屬細(xì)菌是環(huán)境中常見的革蘭氏陰性細(xì)菌,是很多污染物的分解菌株且大部分種屬對(duì)人類危害較小,因此,有較高的潛力應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理中。

    本研究篩選出的菌株可在好氧條件下高效降解苯胺。理化因素對(duì)菌株的影響顯示,該菌株可在溫度為20~40 ℃、pH值為6~9及鹽度為1%~3%的條件下對(duì)苯胺進(jìn)行有效降解。低濃度的鹽離子是微生物生長(zhǎng)所必需的,鹽離子可調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓,維持膜平衡,且對(duì)部分酶促反應(yīng)有促進(jìn)作用。然而,當(dāng)鹽離子濃度過高時(shí),會(huì)對(duì)微生物的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生危害。因此,大多數(shù)細(xì)菌生活在鹽濃度小于1%的環(huán)境中。然而,工業(yè)苯胺廢水中往往含有較高濃度的鹽離子。因此,篩選能在較高鹽濃度下高效處理苯胺廢水的菌株具有重要意義。在本研究中,菌株D5可以在高鹽度條件下對(duì)苯胺進(jìn)行降解,這為該菌株今后應(yīng)用于高鹽度苯胺廢水的工業(yè)化處理提供了條件。該菌株對(duì)較高濃度的苯胺具有良好的降解效率,并可以進(jìn)行苯胺的連續(xù)降解。以上的特性為其日后應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理創(chuàng)造了良好的條件。

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