苯胺降解菌的分離及其降解特性

王浩權(quán) 朱興華 胡惠允 孟祥敏 崔岱宗

摘要：從吉林省吉林市某化工廠附近的土壤中分離到1株可在好氧條件下高效降解苯胺的菌株。經(jīng)16S rDNA序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該菌株與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有較近的親緣關(guān)系，基于此，將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5，該菌株可在溫度為20～40 ℃、pH值為6～9及鹽度為1%～3%的條件下對苯胺進行有效降解;菌株D5可對高濃度苯胺進行降解，可在52 h內(nèi)降解90%以上1 000 mg/L的苯胺;此外，菌株D5可對反復(fù)添加的苯胺連續(xù)降解，以上的特性為其日后應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理創(chuàng)造了良好的條件。

關(guān)鍵詞：苯胺;假單胞菌屬;降解特性

中圖分類號： X172

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0287-04

苯胺（Aniline）是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的一種重要化工原料，是農(nóng)藥、染料、塑料及藥物生產(chǎn)中的重要原料及中間體，廣泛存在于印染、制藥、橡膠及其他諸多化工行業(yè)的生產(chǎn)廢水中[1]。近年來，越來越多的苯胺廢水被排放到自然水體和土壤中。苯胺毒性大且在自然環(huán)境中化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很難降解。苯胺具有嚴重的致癌、致畸、致突變的“三致”作用，并可以造成人或動物心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及其他臟器的損害，嚴重危害接觸者的健康[2-3]?；诖耍绹鴩噎h(huán)境保護局（Environmental Protection Agency，簡稱EPA）已將苯胺列為優(yōu)先控制的污染物，我國及其他各國也將其列為嚴重污染環(huán)境和危害人體健康的污染物[4]。

在自然環(huán)境下，苯胺主要是在各類微生物尤其是好氧細菌的作用下進行生物降解，其降解速率受微生物活性、環(huán)境條件（如溶氧量、溫度、pH值）等因素的顯著影響[5]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對苯胺的微生物降解開展了大量的研究工作，越來越多的苯胺降解細菌得到分離和純化，主要為不動桿菌屬 （Acinectobacter）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、紅球菌屬 （Rhodococcus）、戴爾福特菌屬 （Delftia）細菌[6-8]。此外，許多學(xué)者對苯胺降解相關(guān)酶基因的克隆表達及序列分析、苯胺降解的代謝途徑等進行了研究[9-12]。

雖然對苯胺生物降解的研究已取得了一定進展，但菌體對苯胺降解速度較慢、污染物耐受條件較差等缺點仍然極大地制約了降解菌株的工業(yè)化應(yīng)用。因此，篩選苯胺降解能力更高、抗逆性更強的降解菌株仍然是目前研究工作的重點。

在本研究中，筆者從長期受苯胺廢水污染的環(huán)境中分離出1株可在好氧條件下高效降解苯胺的細菌，并探討不同理化因素對菌株降解苯胺的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中用于篩選苯胺降解細菌的環(huán)境樣品取自吉林省吉林市某染料生產(chǎn)廠附近的土壤。

富集培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，加水至1 L，調(diào)pH值至7.0。

苯胺降解培養(yǎng)基：葡萄糖2 g、NH4Cl 1 g、Na2HPO4 2 g、NaH2PO4 1 g、MgSO4 0.2 g，加水至1 L，調(diào)pH值至7.0。進行降解試驗時添加一定濃度的苯胺。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯胺降解菌株的篩選 稱取1 g環(huán)境樣品，放入裝有50 mL滅菌水的100 mL三角瓶中，將三角瓶置于搖床上在 100 r/min 下振蕩1 h，將振蕩后的懸濁液靜置，上清液即為供接種的樣品。

取1 mL樣品加入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。采用相同方法接種1代培養(yǎng)菌液1 mL至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，使樣品中的好氧菌群得到活化。

向降解培養(yǎng)基中加入苯胺，使培養(yǎng)基中苯胺的終濃度達到200 mg/L，按2%（V/V）接種量接種第2次活化的混合菌液至苯胺降解培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。采用此方法對混合菌液進行連續(xù)篩選培養(yǎng)，觀察苯胺的降解效果，初步確定混合菌液中是否存在能夠高效降解苯胺的菌株。

將篩選后的混合菌群在固體苯胺降解培養(yǎng)基（苯胺濃度200 mg/L）上進行劃線分離，并對長出的單菌落重新進行劃線培養(yǎng)。

將篩選出的菌株轉(zhuǎn)接種于LB液體培養(yǎng)基中，并向其中加入20%甘油作為保護劑，于-40 ℃冰箱中保藏。

1.2.2 苯胺濃度的測定 對苯胺濃度的測定采用萘乙二胺偶氮光度法[13]。

1.2.3 降解菌株的鑒定 采用16S rDNA序列分析方法對分離出的苯胺降解細菌進行鑒定。菌株基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[14]進行提取。以提取的菌株DNA為模板，采用細菌通用引物27F：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′對細菌的16S rDNA序列進行擴增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸 2 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD 18-T質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)中，取50 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下培養(yǎng)16 h，挑取陽性克隆子進行序列測定。測序結(jié)果經(jīng)軟件拼接及人工校對后，通過BLAST程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)庫進行比對并下載相關(guān)序列，采用ClustalX 1.81軟件進行多序列比對，Phylip 3.67軟件對序列進行親緣性及系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4 菌體生長曲線及苯胺降解曲線的測定 將菌種按2%（V/V）接種量接種到含有200 mg/L苯胺的苯胺降解培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 h取樣1次測菌體在600 nm處的吸光值（以液體篩選培養(yǎng)基為空白對照）。

取2 mL菌液在8 000 r/min下離心10 min后測定上清液中的苯胺殘余含量，并計算苯胺的降解率。

1.3 不同理化因素對菌株降解苯胺的影響

1.3.1 溫度對菌體生長及苯胺降解的影響 將經(jīng)活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養(yǎng)基（含有 200 mg/L 苯胺）中，分別置于15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)16 h后，取3 mL菌液測定菌株生長量（D600 nm） 及苯胺的降解率。

1.3.2 pH值對菌體生長及苯胺降解的影響 將經(jīng)活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養(yǎng)基（含有 200 mg/L 苯胺）中，培養(yǎng)基的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)12 h后，取3 mL菌液測定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.3.3 鹽度對菌體生長及苯胺降解的影響 向降解培養(yǎng)基中添加NaCl，使其終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，將經(jīng)活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至無機鹽降解培養(yǎng)基（含有200 mg/L苯胺）中，于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)12 h后，取3 mL菌液測定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.4 苯胺濃度對降解率的影響

在無機鹽降解培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的苯胺（400、600、800、1 000 mg/L），將經(jīng)活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至上述含有不同濃度苯胺的培養(yǎng)基中，于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)，記錄不同濃度苯胺的降解時間及降解率。

1.5 連續(xù)投加苯胺對降解率的影響

將經(jīng)活化后的菌株按2%（V/V）接種量接種至含有 200 mg/L 苯胺的培養(yǎng)基中，于35 ℃好氧條件下培養(yǎng)，待培養(yǎng)基中的苯胺降解完全后，再向培養(yǎng)基中投加苯胺，使培養(yǎng)基中苯胺濃度重新達到200 mg/L，當?shù)?次投加的苯胺降解后，繼續(xù)向培養(yǎng)基中投加苯胺。重復(fù)以上步驟，測定每次投加苯胺的降解率及降解時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯胺高效降解菌株的分離與鑒定

環(huán)境樣品經(jīng)過富集后，在含有苯胺的降解培養(yǎng)基中進行篩選，經(jīng)反復(fù)平板劃線純化，得到1株苯胺降解細菌，命名為D5。對菌株D5的16S rDNA序列進行擴增測序后，結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中的序列信息對該菌株進行分子生物學(xué)鑒定。測序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物的長度為1 500 bp。將序列進行Blast比對后，下載相關(guān)序列，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，基于各菌株的16S rDNA序列利用最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選取枯草芽孢桿菌為外群，大于50%的自展值標記于各分枝上，結(jié)果如圖1所示。本研究篩選出的苯胺降解菌株與假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 聚為一枝，且與黃單胞菌屬 （Xanthomonas） 菌株親緣關(guān)系較近。基于此，筆者認為本研究所分離到的降解菌株屬于銅綠假單胞菌，將該菌株定名為Pseudomonas aeruginosa D5。

2.2 菌株的生長曲線及苯胺的降解曲線

將菌株D5以2%（V/V）接種量接入含有200 mg/L苯胺的無機鹽降解培養(yǎng)基中，測定菌體濃度和菌液中苯胺的殘留量，從而檢測菌株D5在培養(yǎng)基中的生長情況和對苯胺的降解情況。試驗結(jié)果（圖2）表明，菌株D5可在降解培養(yǎng)基中快速生長。在前3 h對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)后，菌株D5在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)對數(shù)生長趨勢，16 h后菌體的D600 nm值可達到約1.65，由此可見200 mg/L苯胺對菌株D5的生長沒有明顯的抑制作用。在菌株生長的同時，培養(yǎng)體系中的苯胺濃度迅速下降，15 h內(nèi)苯胺的降解率即達到90%以上，至18 h培養(yǎng)基中的苯胺已被完全降解。表明菌株D5是1株可在好氧條件下對苯胺進行有效降解的菌株。

2.3 溫度對菌體生長及苯胺降解的影響

本研究采用菌液濁度（D600 nm）來間接反映菌株的生長速率。從圖3可以看出，菌株D5在35 ℃下的生長速率及對苯胺的降解速率均達到最大值。在此溫度下，菌株對200 mg/L

苯胺的16 h降解率達到99%。當溫度在20～40 ℃之間時，菌株D5均保持著對苯胺較高的降解能力。如在40 ℃下，菌株經(jīng)16 h的培養(yǎng)后仍可降解約70%的苯胺;然而，當溫度為50 ℃時，菌株的生長速率急劇下降，苯胺的降解率也明顯降低。

溫度過高或過低均會降低菌株的生長速率并抑制細菌內(nèi)相關(guān)酶的活性，從而造成苯胺降解速率的下降。值得注意地是，菌株D5在低溫下具有一定的苯胺降解能力，當溫度僅為15 ℃時，菌株D5仍可在16 h內(nèi)降解約32%的苯胺。東北三省冬季較寒冷，污水管道內(nèi)的水溫只有10～15 ℃，低溫嚴重影響了活性污泥或降解菌株對污染物的降解速率。因此，篩選出在低溫條件下仍可降解苯胺的菌株具有較為重要的現(xiàn)實意義。

2.4 pH值對菌體生長及苯胺降解的影響

從圖4可以看出，菌株對苯胺降解的最適pH值為7.0，在該pH值條件下，菌株可以在16 h內(nèi)降解約99%的苯胺。當降解培養(yǎng)基的pH值維持在6～9范圍內(nèi)時，pH值的變化并未對細菌的生長和苯胺的降解造成明顯影響，在該pH值范圍內(nèi)，經(jīng)過16 h的培養(yǎng)，菌株D5可對苯胺維持85%以上的降解率。菌株D5有一定的耐堿性，在降解體系pH值為10時，菌株仍可在16 h內(nèi)降解約70%的苯胺。

與溫度變化對細菌降解能力的影響相似，pH值過高或過低均會對苯胺的降解產(chǎn)生負面影響，其原因是過堿和過酸條件可能會影響菌體的生長和與苯胺降解有關(guān)酶的活性。

2.5 鹽度對菌體生長及苯胺降解的影響

從圖5可以看出，當降解體系中的鹽度逐漸增大時，菌株D5的生長速率逐漸減小;與之相對應(yīng)，苯胺的降解速率也逐漸減小。然而， 菌株D5仍具備一定的耐鹽性，當降解體系中

的鹽濃度為1%～3%時，菌株在16 h內(nèi)可對苯胺維持80%以上的降解率，即使當降解體系內(nèi)的鹽度達到5%時，菌株仍可在16 h內(nèi)降解約32%的苯胺。

2.6 苯胺濃度對降解率的影響

從表1可以看出，菌株D5可有效降解不同濃度的苯胺。當苯胺的濃度為400、600、800、1 000 mg/L時，菌株D5可分別在24、30、40、52 h內(nèi)達到90%以上的苯胺降解率。表明菌株D5可在較高濃度的苯胺環(huán)境中生長并高效降解苯胺，說明菌株D5對高濃度的苯胺廢水具有極大的降解潛力。

2.7 連續(xù)投加苯胺對降解率的影響

從圖6可以看出，菌株D5可在16 h內(nèi)對降解體系中第1次添加的苯胺基本完全降解（降解率大于98%）。在第2與第3次添加苯胺后，菌株D5均可在16 h內(nèi)降解90%以上的苯胺。在第4次添加苯胺后，菌株對苯胺的降解速率稍有變慢，培養(yǎng)16 h后約有80%的苯胺被降解。表明菌株D5有能力對連續(xù)添加的苯胺進行降解。

苯胺降解變緩可能是由于降解體系中營養(yǎng)成分逐漸耗盡，剩余營養(yǎng)成分已經(jīng)不能滿足菌體的生長和代謝。另外，降解體系中的pH值、溶氧量等理化因素也越來越不適合菌體的生長。

3 結(jié)論與討論

本研究在化工廠附近的土壤中分離到1株可以在好氧條件下對苯胺進行降解的菌株D5。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后發(fā)現(xiàn)，該菌株與銅綠假單胞菌有較近的親緣關(guān)系。之前已經(jīng)有報道證明，假單胞菌屬細菌可在好氧條件下高效地降解苯胺類化合物，如Oliver等從活性污泥中分離到的假單胞菌屬細菌可以降解濃度為100 mg/L以下的二苯胺[15];Bengtson等在工業(yè)廢水中篩選出的假單胞菌屬細菌可有效降解低濃度的氯代苯胺，然而，當降解底物濃度過大時，菌株的生長受到明顯抑制[16]。假單胞菌屬經(jīng)菌細胞內(nèi)含有苯胺雙加氧酶（aniline dioxygenase），可將苯胺氧化為鄰苯二酚，鄰苯二酚通過鄰苯二酚2，3-雙加氧酶 （catechol-2，3-dioxygenase） 繼續(xù)氧化，最后生成丙酮酸和乙醛，進入三羧酸循環(huán)，徹底得到礦化。假單胞菌屬細菌是環(huán)境中常見的革蘭氏陰性細菌，是很多污染物的分解菌株且大部分種屬對人類危害較小，因此，有較高的潛力應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理中。

本研究篩選出的菌株可在好氧條件下高效降解苯胺。理化因素對菌株的影響顯示，該菌株可在溫度為20～40 ℃、pH值為6～9及鹽度為1%～3%的條件下對苯胺進行有效降解。低濃度的鹽離子是微生物生長所必需的，鹽離子可調(diào)節(jié)細胞滲透壓，維持膜平衡，且對部分酶促反應(yīng)有促進作用。然而，當鹽離子濃度過高時，會對微生物的正常生長產(chǎn)生危害。因此，大多數(shù)細菌生活在鹽濃度小于1%的環(huán)境中。然而，工業(yè)苯胺廢水中往往含有較高濃度的鹽離子。因此，篩選能在較高鹽濃度下高效處理苯胺廢水的菌株具有重要意義。在本研究中，菌株D5可以在高鹽度條件下對苯胺進行降解，這為該菌株今后應(yīng)用于高鹽度苯胺廢水的工業(yè)化處理提供了條件。該菌株對較高濃度的苯胺具有良好的降解效率，并可以進行苯胺的連續(xù)降解。以上的特性為其日后應(yīng)用于苯胺廢水的工業(yè)化處理創(chuàng)造了良好的條件。

參考文獻：

[1]Itoh N，Morinaga N，Kouzai T. Oxidation of aniline to nitrobenzene by nonheme bromoperoxidase[J]. Biochemistry and Molecular Biology International，1993，29（4）：785-791.

[2]王姝婷，蔡磊明. 苯胺好氧生物降解性的測試[J]. 農(nóng)藥，2005，44（6）：251-253.

[3]黎鳳姣，趙海軍，王尚德. 工業(yè)苯胺廢水的處理[J]. 精細化工中間體，2002，32（1）：42-43，51.

[4]Bhunia F，Saha N C，Kaviraj A. Effects of aniline-an aromatic amine to some freshwater organisms[J]. Ecotoxicology，2003，12（5）：397-404.

[5]李金榮，楊振放，吳耀國，等. 反硝化作用下苯胺降解的實驗研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（6）：2179-2182.

[6]Konopka A，Knight D，Tureo R F. Characterization of a Pseudomonas sp. capable of aniline degradation in the presence of secondary carbon sources[J]. Applied and Environmental Microbiology，1989，55（2）：385-389.

[7]Fujii T，Takeo M，Maeda Y. Plasmid-encoded genes specifying aniline oxidation from Acinectobacter sp. strain YAA[J]. Microbiology，1997，143（Pt1）：93-99.

[8]Murakami S，Takemoto J，Takashima A，et al. Purification and characterization of two muconate cycloisomerase isozymes from aniline-assimilating Frateuria species ANA-18[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1998，62（6）：1129-1133.

[9]周 霞，鄭先強，佟樹敏，等. 苯胺降解菌的特性研究及分子生物學(xué)基礎(chǔ)[J]. 南開大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，37（2）：24-28，33.

[10]Murakami S，Hayashi T，Maeda T，et al. Cloning and functional analysis of aniline dioxygenase gene cluster，from Frateuria species ANA-18，that metabolizes aniline via an ortho-cleavage pathway of catechol[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2003，67（11）：2351-2358.

[11]Boon N，Goris J，de Vos P，et al. Bioaugmentation of activated sludge by an indigenous 3-chloroaniline-degrading Comamonas testosteroni strain，I2gfp[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（7）：2906-2913.

[12]Fuchs K，Schreiner A，Lingens F. Degradation of 2-methylaniline and chlorinated isomers of 2-methylaniline by Rhodococcus rhodochrous strain CTM[J]. Journal of General Microbiology，1991，137（8）：2033-2039.

[13]中國標準出版社第二編輯室.水質(zhì)分析方法國家標準匯編[M]. 北京：中國標準出版社，1996：169-171.

[14]Cui D Z，Zhao M，Li G F，et al. Decolorization of azo dyes by a new strain CD-2 isolated from the textile dye contaminated water [J]. Advanced Materials Research，2011，183/184/185：381-386.

[15]Oliver D，Karl-Heinz B. Microbial degradation of diphenylamine under anoxic conditions[J]. Current Microbiology，1997，35（6）：343-347.

[16]Bengtsson G，Carlsson C. Contribution of suspended and sorbed groundwater bacteria to degradation of dissolved and sorbed aniline[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57（1/2）：234-241. 范嘉智，譚詩琪，羅 宇，等. 湖南省最適干旱指數(shù)研究及近50年干旱演變分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（15）：291-295，306.