6種常見食材抗氧化及抑制乙酰膽堿酯酶活性

王馨悅 陳華國 周欣

摘要：以黑莓、桑椹、紅布李、紫薯、黑米、黑豆為試驗(yàn)材料，乙醇為溶劑，對6種食材進(jìn)行花青素提取;采用DPPH和ABTS 2種方法測定6種提取物的抗氧化活性，利用Pearson原理分析6種提取物中花青素含量與抗氧化活性的相關(guān)性，初步探索二者規(guī)律;并采用分光光度法測定花青素提取物對乙酰膽堿酯酶抑制活性，以期為花青素的深度研究及開發(fā)利用提供參考。結(jié)果表明，6種食材提取物均具有良好的抗氧化活性，清除自由基能力大小順序?yàn)榧t布李>桑椹>黑莓>紫薯≈黑米>黑豆，其中紅布李提取物清除DPPH自由基能力與維生素C相近，其IC50值為39.38 μg/mL，且花青素含量與抗氧化能力顯著正相關(guān);研究發(fā)現(xiàn)5種食材花青素提取物均對乙酰膽堿酯酶有抑制作用。

關(guān)鍵詞：花青素;抗氧化;抑制乙酰膽堿酯酶;DPPH;ABTS

中圖分類號： Q946.83+6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0208-04

隨著人們生活水平的提高，健康養(yǎng)生已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。花青素是廣泛存在于植物花瓣、果實(shí)組織及莖葉的表面細(xì)胞與下表皮層中的一類可溶于水的天然色素，具有抗氧化、降血糖、降血脂、減肥、抗炎、改善視力等多種藥理作用，因此花青素成為當(dāng)今國內(nèi)外科技工作者研究的熱點(diǎn)之一。富含花青素的植物尤以果蔬居多，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)：在27個(gè)科，73個(gè)屬植物組織中均含有一定含量的花青素，如桑椹、紫薯、葡萄、紫甘藍(lán)等[1]，另外多數(shù)黑色雜糧也富含花青素，黑米，黑豆是工業(yè)中提取矢車菊素的常見原料。

目前對花青素的研究集中在花青素的提取分離純化方法、抗氧化活性方面以及少部分的含量測定和組分鑒定的研究，研究內(nèi)容和形式略顯單一，大多數(shù)研究僅限于對某一種樣品（藍(lán)莓、紫甘藍(lán)等）的提取工藝或某一類物質(zhì)（特別是矢車菊素）的含量測定及抗氧化活性的單方面研究，對常見食材如水果紅布李等的研究及其他生物活性特別是抑制乙酰膽堿酯酶活性的研究略為缺乏。因此，多方面、多維度深度綜合評價(jià)花青素的性質(zhì)已是一種趨勢。眾所周知，乙酰膽堿酯酶是目前治療阿爾茨海默癥的有效靶點(diǎn)之一，通過對乙酰膽堿酯酶的可逆性抑制，可有效緩解或治療老年癡呆癥。本研究選擇6種不同植物來源的食材為研究對象，其中包括蔬菜（紫薯）、水果（黑莓、紅布李、桑椹）、糧食（黑米、黑豆），對其花青素提取物的含量與抗氧化活性進(jìn)行對比，并進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探索花青素含量與抗氧化活性的規(guī)律，并對6種樣品提取物抑制乙酰膽堿酯酶活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓、桑椹、紅布李、紫薯、黑米、黑豆均采購于貴州省貴陽市云巖區(qū)富水北路北京華聯(lián)超市。

所用藥品試劑有2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（分析純，美國Sigma公司生產(chǎn)）;5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）（分析純，貴州迪大科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)）;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純，貴州迪大科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)）;矢車菊-3-O-葡萄糖苷，維生素C（分析純，貴州迪大科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)）;乙酰膽堿酯酶（AChE）（分析純，大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;碘代硫代乙酰膽堿（ATCI）（分析純，大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;乙腈（色譜純，美國Tedia公司生產(chǎn)）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司生產(chǎn)）;Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司生產(chǎn)）;XS 105十萬分之一分析天平、AL 204萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)];R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司生產(chǎn)）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）;Eppendorf research plus微量移液器（德國Eppendorf公司生產(chǎn)）;TD5M低速離心機(jī)（長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)）;三洋微波爐EM-202MS1（合肥榮事達(dá)三洋電器有限公司生產(chǎn)）;美的攪拌機(jī)MJ-220BP01A（廣東美的生活電器制造有限公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗(yàn)方法

整個(gè)試驗(yàn)于2017年在貴州師范大學(xué)山地環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.1 樣品的制備 花青素的提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[2]并略作修改，新鮮果蔬粉碎勻漿后，以1 ∶ 10的料液比加入52%的乙醇溶液，微波提取4 min（微波功率469 W），提取液于低速離心機(jī)3 500 r/min離心5 min后取上清液減壓濃縮，存放于 -4 ℃，備用。花青素的純化：參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期工作[3]，將粗提物加水稀釋至花青素濃度為0.75 mg/mL，HCl調(diào)節(jié)pH值為1。聚酰胺樹脂（60～100目）用95%乙醇煮沸4 h后以純水洗凈，作為填料，裝柱，將稀釋后的樣品提取物以5 BV/h的速度上柱5 BV，隨后用3 BV純水洗脫，再用pH值為3的80%乙醇以5 BV/h的速度洗脫3.5 BV，洗脫液經(jīng)減壓濃縮后真空冷凍干燥得樣品粉末，裝于棕色瓶，保存在干燥器中?；ㄇ嗨氐乃猓喝? mL樣品溶液（約1 mg/mL）加入到比色管中，再加入4 mL高濃度鹽酸水解液（鹽酸 ∶ 水 ∶ 甲醇體積比=1 ∶ 1 ∶ 2）搖勻，沸水中水浴1 h，冷卻至室溫，備用。

1.3.2 樣品中花青素含量的測定 取1 mL花青素樣品溶液（以52%乙醇溶液為空白）加入到10 mL比色管中，加入 5 mL 的1%鹽酸甲醇溶液讓其顯色，充分振蕩搖勻，50 ℃水浴10 min，取出，冷卻至室溫，于530 nm處測定其吸光度[2]。

1.3.3 6種樣品花青素成分分析 采用高效液相色譜法對樣品中花青素種類進(jìn)行初步分析，液相色譜條件參照胡莉等方法[4]并稍作修改。色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相A為水（含0.33%甲酸），B為乙腈;進(jìn)樣量為20.0 μL，柱溫為35 ℃，檢測波長為530 nm，梯度洗脫程序見表1。

1.3.4 ABTS自由基清除能力測試 ABTS自由基溶液[5]由14 mmol/L ABTS溶液和5 mmol/L K2S2O8水溶液以1 ∶ 1的比例混合后避光反應(yīng)12～16 h后使用，使用時(shí)稀釋50倍。樣品溶液（Di）的制備，分別取0.2 mL不同濃度的花青素樣品溶液于1.5 mL的離心管中，再加入0.8 mL ABTS自由基溶液混合均勻，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測定吸光度。以0.8 mL 52%乙醇代替ABTS溶液為對照（Dj），測定吸光度，空白（D0）以相同體積水代替樣品溶液，根據(jù)計(jì)算公式：清除率=（D0-Di-Dj）/D0×100%;計(jì)算樣品ABTS自由基清除率。以維生素C為對照品，以維生素C濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以ABTS自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)，得出線性回歸方程：y=5.330 8x-29.260 0（r2=0.951 9）。花青素樣品的ABTS自由基清除能力以IC50（μg/mL）表示。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測試 參考Kim等的方法[6]略有改動(dòng)，進(jìn)行DPPH自由基清除試驗(yàn)。稱取9.86 mg DPPH溶于無水乙醇溶液中，定容100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別取 0.2 mL 不同濃度的花青素樣品溶液于1.5 mL離心管中，加入0.8 mL DPPH乙醇溶液，37 ℃避光反應(yīng)30 min后，以乙醇作對照，在波長517 nm處測定吸光度，空白溶液以相同體積52%乙醇代替樣品反應(yīng)，計(jì)算樣品DPPH自由基清除率。以維生素C為對照品，以維生素C濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以DPPH自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)，得出線性回歸方程：y=1.1092x-7.237 2（r2=0.997 0）?；ㄇ嗨貥悠返腄PPH自由基清除能力以IC50（μg/mL）表示。

1.3.6 抑制乙酰膽堿酯酶活性測試 采用改良的Ellman等的分光光度法[7]對6種不同果蔬的花青素提取物進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性抑制研究。方法如下：將樣品以52%乙醇溶解稀釋至不同質(zhì)量濃度的樣液。整個(gè)反應(yīng)在酶標(biāo)板中進(jìn)行，反應(yīng)體系中各加入20 μL樣液、120 μL 0.1 mol/L PBS（pH值72）、20 μL乙酰膽堿酶（0.64 μg/mL）和20 μL 75 mmol/L ATCI溶液，在37 ℃保溫20 min后加入20 μL DTNB溶液，室溫下避光放置20 min后立即在波長405 nm處測量吸光度（D樣品）。52%乙醇代替樣品溶液測得空白值為D空白;PBS代替酶溶液的空白溶液吸光度為D空白本底，PBS代替酶溶液測定樣品溶液的吸光度為D樣品本底。以氫溴酸加蘭他敏為陽性對照，乙酰膽堿酯酶活性抑制率=[（D空白-D空白本底）-（D樣品-D樣品本底）]/（D空白-D空白本底）×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值表示，使用Excel 2016和SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種提取物中花青素含量的測定

由圖1可知，經(jīng)初步純化后6種樣品的花青素含量高低順序?yàn)樯ｉ?黑莓>紅布李>黑米>紫薯>黑豆。桑椹樣品中花青素含量最高，為53.78%;其余5種樣品的含量依次為46.14%、36.44%、26.05%、12.63%、6.80%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，黑莓中還含有豐富的非花色苷類多酚類物質(zhì)，主要是黃烷醇和黃酮醇等，紅布李中也含有豐富的酚類物質(zhì)。

2.2 6種提取物中花青素成分分析

由于自然界中游離態(tài)花青素苷元極少，多數(shù)花青素通過糖基化或?；€(wěn)定存在果蔬中，這使得花青素種類繁多且極性相近，給研究帶來諸多不便[8]，因此，以水解后的樣品提取物及矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對象簡要分析各樣品中所含花青素的苷元種類。水解后的矢車菊-3-O-葡萄糖苷在11.895 min處有強(qiáng)吸收，如圖2-A所示。從圖2-B可知，紫薯中所含花青素種類較多，在11.917 min處的吸收較弱說明矢車菊素及其衍生物含量較低，但在15.823 min有強(qiáng)吸收峰，該色譜峰為芍藥色素，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的紫薯花青素主要為芍藥色素及其衍生物，也含有少量的矢車菊素的結(jié)論一致。另外，根據(jù)圖2-C中與矢車菊3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的水解色譜圖出峰時(shí)間對比可知，桑椹、黑莓、黑米、紅布李提取物水解后的主要產(chǎn)物為矢車菊素，說明這4種樣品提取物中所含花青素主要為矢車菊素及其衍生物，因此工業(yè)中常用黑米或黑豆作為提取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的原料。文獻(xiàn)報(bào)道黑莓中所含花青素也是主要為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，經(jīng)過色譜圖比對可知黑米中也含有少量的芍藥色素，這與Fabroni等的研究結(jié)論[9]一致。

2.3 抗氧化活性

維生素C是一種公認(rèn)的具有強(qiáng)抗氧化活性的物質(zhì)，常作為抗氧化活性研究的陽性對照，通過與維生素C對比可評價(jià)被測物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)弱。DPPH和ABTS自由基清除能力的結(jié)果通過SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以IC50值表示，IC50值越小，說明DPPH和ABTS自由基清除能力越強(qiáng)。根據(jù)表2可知，6種樣品中紅布李的抗氧化活性最強(qiáng)，DPPH的IC50值最小，為39.38 μg/mL，其DPPH自由基清除能力接近于維生素C（38.55 μg/mL），高于矢車菊素3-O-葡萄糖苷（42.65 μg/mL），其余5種樣品相對較弱，以黑豆提取物最弱。各提取物對ABTS自由基的清除能力都較強(qiáng)，矢車菊素、紅布李、桑椹三者的清除能力接近?？偟膩碚f，各個(gè)樣品對ABTS和DPPH自由基清除能力的趨勢基本一致。其中DPPH自由基清除率大小順序?yàn)榫S生素C>紅布李>矢車菊素-3-O-葡萄糖苷>桑椹>黑莓>紫薯>黑米>黑豆，ABTS自由基清除率大小順序?yàn)榫S生素C>矢車菊素-3-O-葡萄糖苷>紅布李>桑椹>黑莓>黑米>紫薯>黑豆。

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