葡萄生單軸霉菌對(duì)葡萄幾種防御酶活性的影響

杜蕙 王春明 郭建國(guó) 漆永紅 蔣晶晶

摘要：以不同抗感霜霉病的葡萄品種高妻、夏黑、紅地球及瑞比爾為材料，通過室內(nèi)人工接種方法研究葡萄生單軸霉菌侵染后不同葡萄品種過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及過氧化氫酶（CAT）活性的變化。結(jié)果表明，受葡萄生單軸霉菌侵染后不同抗性品種POD、PPO、PAL和CAT活性與對(duì)照相比均明顯提高，抗病品種酶活性較感病和高感品種上升快且維持較高活性水平，抗性品種酶活性均出現(xiàn)2個(gè)高峰，第1個(gè)酶活性高峰較感病品種出現(xiàn)得早;抗病品種CAT和PAL活性較感病品種上升幅度更大，維持時(shí)間更長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：葡萄生單軸霉菌;過氧化物酶;多酚氧化酶;苯丙氨酸解氨酶;過氧化氫酶;葡萄霜霉病抗性機(jī)制

中圖分類號(hào)：S436.631

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0151-03

植物的抗病反應(yīng)是寄主-病原物相互作用過程中所產(chǎn)生的一系列生理生化效應(yīng)，保護(hù)反應(yīng)是復(fù)雜的新陳代謝的結(jié)果，植物對(duì)病原物侵入的生理反應(yīng)是通過酶的催化活動(dòng)實(shí)現(xiàn)的。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及過氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶和防御酶。大量研究表明，這些酶在寄主與病原物互作中與植物的抗病性有著重要的關(guān)系[1-3]。

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉（Plasmopara viticola）引起的葡萄生產(chǎn)上最重要的病害之一，世界各地葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是一種世界性病害[4-5]。據(jù)調(diào)查，2010年我國(guó)葡萄栽培面積達(dá)55.2萬hm2，嚴(yán)重發(fā)病地塊的葡萄霜霉病發(fā)生率高達(dá)70%以上。1834年在美國(guó)東北部的野葡萄上首次發(fā)現(xiàn)了葡萄霜霉病[6-7]。我國(guó)1899年發(fā)現(xiàn)該病危害[8]，目前幾乎所有的葡萄產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，潮濕多雨地區(qū)危害更為嚴(yán)重，發(fā)病時(shí)嚴(yán)重影響樹勢(shì)和果實(shí)品質(zhì)[9]。關(guān)于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品種抗病性鑒定、病菌致病性分化及抗藥性等方面[10-14]，而與抗性有關(guān)的防御酶活性研究較少。因此，本研究以生產(chǎn)中主栽的鮮食葡萄品種為材料，研究不同抗性葡萄品種感染葡萄生單軸霉菌后POD、PPO、PAL及CAT活性的變化，以期豐富葡萄霜霉病抗性機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葡萄品種為高妻、夏黑、紅地球、瑞比爾。

供試葡萄品種于2013年秋季扦插于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室中。2014年8月從田間采集新鮮的葡萄霜霉病葉片，用自來水反復(fù)沖洗掉老孢子囊后，在20 ℃條件下黑暗保濕培養(yǎng)24～48 h，待新孢子囊長(zhǎng)出后用毛筆刷下新鮮孢子囊，用無菌水配制成濃度為1×105～1×106個(gè)/mL孢子囊懸浮液備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 品種抗性評(píng)價(jià) 采用室內(nèi)離體葉片法結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查進(jìn)行品種抗性評(píng)價(jià)。室內(nèi)離體葉片測(cè)定時(shí)分別采集供測(cè)試葡萄品種新梢大小和葉齡基本一致的健康葉片，將事先準(zhǔn)備好的孢子囊懸浮液用喉頭噴霧器在葉片背面均勻噴灑10 mL，然后將葉片正面朝下放在鋪有4層無菌水浸濕滅菌紗布的瓷盤中，為避免葉片與濕紗布接觸腐爛，在葉片下放置玻璃棒，葉柄用脫脂棉保濕，磁盤用保鮮膜覆蓋密封，于 20 ℃ 條件下黑暗保濕培養(yǎng)。以噴等量清水為對(duì)照，每個(gè)品種接種10張葉片，重復(fù)3次。逐日觀察記錄發(fā)病情況，最后用接種后7 d的調(diào)查數(shù)據(jù)計(jì)算病情指數(shù)。

田間自然發(fā)病調(diào)查參考劉天明等的方法[15]，2014年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所葡萄園分別在霜霉病初發(fā)期（7月5日）、盛發(fā)期（8月16日）及發(fā)病后期（9月22日）共進(jìn)行3次調(diào)查，每個(gè)品種選取20個(gè)新發(fā)的枝條，每個(gè)枝條自上而下調(diào)查10個(gè)葉位相同的葉片，記錄發(fā)病情況，計(jì)算平均病情指數(shù)。室內(nèi)及田間病害調(diào)查分級(jí)方法按照0級(jí)：無病斑;1級(jí)：病斑面積占葉面積5%及以下;3級(jí)：病斑面積占葉面積6%～25%;5級(jí)：病斑面積占葉面積26%～50%;7級(jí)：病斑面積占葉面積51%～75%;9級(jí)：病斑面積占葉面積76%及以上進(jìn)行。品種抗性評(píng)價(jià)參考劉新秀等的5級(jí)分級(jí)法[16]：免疫（I）：病情指數(shù)為0;高抗（HR）：病情指數(shù)為0.1～5.0;抗病（R）：病情指數(shù)為5.1～25.0;感?。⊿）：病情指數(shù)為25.1～50.0;高感（HS）：病情指數(shù)為50.1～100.0。

1.2.2 酶活性測(cè)定 將配制好的孢子囊懸浮液，采用噴霧法接種于溫室盆栽葡萄苗葉片上，噴清水為對(duì)照，接種后保濕24 h。并于接種后24、48、72、96 h分別采集長(zhǎng)勢(shì)一致、相同葉齡葡萄葉片進(jìn)行酶活性測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次。所采集樣品迅速放入液氮中速凍0.5 h后，置于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

POD、PPO、PAL、CAT活性測(cè)定用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。POD活性以1 g組織在反應(yīng)體系中1 min使470 nm處的吸光度變化0.01，定義為1個(gè)酶活性單位;PPO活性以1 min 1 g組織在反應(yīng)體系中使525 nm處的吸光度變化0.01，定義為 1個(gè)酶活性單位;PAL活性以1 g組織在反應(yīng)體系中1 h使 290 nm 下吸光度變化0.1，定義為1個(gè)酶活性單位;CAT活性以 1 g 組織在反應(yīng)體系中1 min使240 nm下吸光度變化01，定義為1個(gè)酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性評(píng)價(jià)

通過室內(nèi)離體接種結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查，根據(jù)病情指數(shù)進(jìn)行葡萄抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果如表1所示，高妻、夏黑對(duì)霜霉病表現(xiàn)為抗病（R），紅地球?qū)λ共”憩F(xiàn)為感病（S），瑞必爾表現(xiàn)為高感（HS）。各品種在室內(nèi)接種條件下病情指數(shù)均高于田間自然發(fā)病的病情指數(shù)。因?yàn)槭覂?nèi)離體接種所提供的環(huán)境

2.2 不同葡萄品種酶活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 不同品種PPO活性測(cè)定結(jié)果 接種霜霉病菌后各品種PPO活性變化見圖1。與對(duì)照相比，各品種活性均有明顯提高，且不同品種之間存在差異。抗性品種接種后酶活性迅速升高，且在48、96 h出現(xiàn)2個(gè)酶活性高峰，活性維持時(shí)間較長(zhǎng);感病和高感品種接種后酶活性變化較為緩慢，且只在72 h出現(xiàn)了1個(gè)酶活性高峰，隨后迅速下降。整個(gè)測(cè)試期間PPO活性表現(xiàn)為抗性品種﹥感病品種﹥高感品種。

2.2.2 不同葡萄品種POD活性測(cè)定結(jié)果 接種霜霉病菌后各品種POD活性變化見圖2。各品種酶活性與對(duì)照相比均有明顯提高，且不同品種酶活性變化情況不同?？剐云贩N接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h出現(xiàn)2個(gè)酶活性高峰，活性維持時(shí)間較長(zhǎng);感病和高感品種接種后酶活性緩慢增加，且只在72 h出現(xiàn)了1個(gè)小的酶活性高峰，隨后迅速下降，高感品種下降速度更快。整個(gè)測(cè)試期間抗性品種PPO活性維持在較高的水平。

2.2.3 不同葡萄品種CAT活性測(cè)定結(jié)果 接種霜霉病菌后各品種CAT活性變化見圖3。各品種酶活性與對(duì)照相比均有明顯提高，且不同品種酶活性變化不同。抗性品種接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h時(shí)出現(xiàn)2個(gè)酶活性高峰，活性維持時(shí)間較長(zhǎng);感病和高感品種接種后酶活性緩慢增加，酶活性出現(xiàn)高峰的時(shí)間（72 h）較抗性品種晚，隨后迅速下降。 24～120 h內(nèi)抗性品種較感病和高感品種CAT活性長(zhǎng)時(shí)間維持在更高的水平。

2.2.4 不同葡萄品種PAL活性測(cè)定結(jié)果 不同品種接種霜霉病菌后PAL活性變化見圖4，各品種酶活性與對(duì)照相比均有明顯提高，且不同抗性品種酶活性變化不同?？剐云贩N接種后酶活性升高速度快，且在48、96 h時(shí)出現(xiàn)2個(gè)酶活性高峰，活性維持時(shí)間較長(zhǎng);感病品種接種后酶活性緩慢增加，且只在72 h出現(xiàn)了1個(gè)酶活性高峰， 隨后迅速下降， 高感品種

下降速度更快。整個(gè)測(cè)試期間抗性品種PAL活性維持在較高的水平。

3 結(jié)論與討論

通過不同抗性水平4個(gè)葡萄品種受葡萄生單軸霉菌侵染后PPO、POD、CAT及PAL這4種酶活性的變化可以看出，不同抗性品種受葡萄生單軸霉菌侵染后POD、PPO、PAL和CAT活性與對(duì)照相比均明顯提高，抗病品種酶活性較感病和高感品種上升快且維持在較高活性水平，酶活性均出現(xiàn)2個(gè)高峰，第1個(gè)酶活性高峰較感病和高感品種出現(xiàn)得早;抗病品種CAT和PAL較感病品種活性上升幅度更大，維持時(shí)間更長(zhǎng)，這與許多學(xué)者的研究結(jié)果[17-20]一致。

植物與病原物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中，植物形成了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制抵御病原物的入侵。植物對(duì)病原物侵入的生理反應(yīng)是以酶的催化活動(dòng)實(shí)現(xiàn)的。植物體內(nèi)的POD、CAT、PPO、PAL等防御酶都與抗病性有關(guān)[21-22]。其中，POD、CAT共同組成一個(gè)防御體系，能有效清除植物體內(nèi)的自由基和過氧化物[23]。PAL是莽草酸途徑的關(guān)鍵性酶，是酚代謝的主要酶之一，它的活性與酚類化合物的合成密切相關(guān)。酚的代謝產(chǎn)物被證實(shí)是潛在的抗病因子。酚被氧化產(chǎn)生活性很高的醌，而醌對(duì)病菌是有毒的。多酚的氧化與PPO和POD有關(guān)，PPO和POD活性大幅度提高可以大大增加酚氧化物的含量。另外，PPO、POD和PAL參與了木質(zhì)素的合成，尤其是PPO和POD。一方面細(xì)胞壁的高度木質(zhì)化對(duì)病菌的侵染和擴(kuò)展有一定的限制作用。另一方面木質(zhì)素對(duì)病菌是有毒的，葡萄抗霜霉病品種中PPO、POD活性增加，促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，增加了其防御功能。受病原菌侵染后酶活性迅速升高且抗性品種升高的幅度大于感病品種，從而表現(xiàn)對(duì)病害的抗性。因此，抗性組合中寄主受病原菌侵染后迅速產(chǎn)生足夠量的酚類化合物及木質(zhì)素，從而產(chǎn)生過敏性反應(yīng)，殺死病菌，起到抗病的作用。感病組合不能產(chǎn)生足夠量的酚類化合物，因此無過敏性反應(yīng)產(chǎn)生，不能殺死病菌。

本試驗(yàn)酶活性測(cè)定結(jié)果表明，葡萄葉片受到葡萄生單軸霉菌侵染后，PPO、POD、PAL及CAT活性增加在抗性品種中均明顯高于感病和高感品種。盡管如此，也有一些觀點(diǎn)認(rèn)為酚類物質(zhì)的積累和酚氧化物活性的增加與植物抗病反應(yīng)無聯(lián)系。不同的酶系在不同的寄主-病原物互作中的作用是有差異的，而且在不同的寄主與病原物組合中，同一種酶活性變化也不一致。因此，一種酶在抗病中的作用應(yīng)根據(jù)具體情況具體分析，不能一概而論。

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