保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

蘇文政 吳家強(qiáng) 馬建軍 黃保華 蔣慧 王可 張玉玉

摘要：為了研究保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)特征及編碼蛋白的功能，根據(jù)GenBank中其基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物，以保加利亞乳桿菌MN株的基因組為DNA模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因，將其克隆到pMD-19T載體上，進(jìn)行測(cè)序與生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，MN株N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因序列編碼217個(gè)氨基酸，與GenBank中公開(kāi)的N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因核苷酸序列的同源性為98.8%～100.0%;蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量為24.55 ku，理論等電點(diǎn)為9.83;該蛋白屬于親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主;該蛋白的第16～38位氨基酸殘基組成跨膜區(qū)，第56～216位氨基酸殘基組成LYZ2結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果為今后探討N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的生物學(xué)功能及其功能改造奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌;N-乙酰胞壁質(zhì)酶;克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0099-04

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，簡(jiǎn)稱LB）是可用于保健食品的益生菌菌種之一，具有維持微生態(tài)平衡和胃腸道健康、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、增強(qiáng)免疫功能及抗癌抗腫瘤等重要生理功能[1]。N-乙酰胞壁質(zhì)酶（N-acetylmuramidase）是LB的關(guān)鍵自溶酶，可水解肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸間的β-1，4糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁，引起菌體自溶[2-3]。

自溶現(xiàn)象是菌體在不利條件下維持生存的一種自我保護(hù)行為[4-5]。發(fā)酵的乳制品不同時(shí)，乳酸菌自溶的利弊也不相同[6-7]。在干酪生產(chǎn)中，乳酸菌自溶釋放的蛋白酶、肽酶和脂肪酶將干酪中的蛋白質(zhì)、多肽和脂肪水解為游離氨基酸、脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)，從而促進(jìn)干酪的成熟，并賦予干酪良好的風(fēng)味[8]。而在酸奶發(fā)酵劑的生產(chǎn)中，乳酸菌自溶制約著菌體的增殖，不利于菌株的高密度培養(yǎng)[6]。因此，調(diào)控乳酸菌自溶的發(fā)生時(shí)間和程度，有利于縮短發(fā)酵乳制品和發(fā)酵劑的生產(chǎn)周期，改善產(chǎn)品風(fēng)味，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究從LB MN株中克隆了N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因，并綜合應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析其基因結(jié)構(gòu)及功能，為今后深入開(kāi)展N-乙酰胞壁質(zhì)酶的功能改造及LB自溶活性的調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和載體

德氏乳桿菌保加利亞亞種MN株，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存;pMD19-T克隆載體，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

Dream Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ，為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank中保加利亞乳桿菌ATCC 11842（NC_008054.1）的基因組序列，應(yīng)用Primer primer 5.0設(shè)計(jì)N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的特異引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。上游引物：5′-GGAGCACCATATGATGGCTGGACACAGAAA-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTAATTATCGTACTTATTCAGGTTG-3′。在上、下游引物的5′端分別引入Nde Ⅰ和BamHⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)（分別為CATATG、GGATCC）。該引物擴(kuò)增具有完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因片段，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為676 bp。

1.4 目的基因的擴(kuò)增與克隆

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取保加利亞乳桿菌MN株的基因組DNA作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（10 mmol/L），各2 μL上、下游引物（10 μmol/L），3 μL模板DNA，0.25 μL Dream Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，將目的片段與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所有試驗(yàn)于2017年在山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 序列比對(duì)分析

利用DNA Star軟件對(duì)已經(jīng)獲得的N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因序列片段進(jìn)行拼接，并推導(dǎo)其氨基酸序列;運(yùn)用Megalign程序?qū)N株及GenBank中已發(fā)表的10株保加利亞乳桿菌的該基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，運(yùn)用MEGA 4軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 Mur蛋白的生物信息學(xué)分析

用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的理化特性;用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和跨膜方向;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽;用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親疏水性;用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn);用Hopfield HNN（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);用Smart（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域;用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆與鑒定

以保加利亞乳桿菌MN株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因。由圖1可以看出，電泳檢測(cè)可見(jiàn) 676 bp大小的條帶，與預(yù)期目的基因的片段大小相符。將該基因片段與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中后，提取重組質(zhì)粒pMD19-T-mur，PCR能擴(kuò)增出676 bp大小的目的基因片段，雙酶切重組質(zhì)?？汕谐?63 bp大小的目的片段和2 692 bp大小的載體片段（圖2），表明克隆的 N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因已成功插入pMD19-T載體中。

2.2 基因序列分析

測(cè)序得到的MN株N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的核苷酸序列見(jiàn)圖3，將該序列與GenBank中10株保加利亞乳桿菌的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，核苷酸同源性達(dá)到 98.8%～100%。用MEGA 4繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，由圖4可以看出，MN株與CNCM I-1519株、LBVIB27株之間的親緣關(guān)系最近。

2.3 MN株N-乙酰胞壁質(zhì)酶的生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白質(zhì)的理化特性 用ProtParam針對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，MN株N-乙酰胞壁質(zhì)酶含有217個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為24 546.17 u，理論等電點(diǎn)（pI值）為9.83;該蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，其中丙氨酸（Ala）和賴氨酸（Lys）含量最豐富，均達(dá)到10.1%;總帶正電荷殘基、帶負(fù)電荷殘基數(shù)分別是33、16個(gè);不穩(wěn)定指數(shù)為33.04，被分類為穩(wěn)定蛋白質(zhì);脂肪族系數(shù)為85.02; 其總平均疏水指數(shù)為

-0.461，為親水性蛋白。

2.3.2 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)分析 用TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)N-乙酰胞壁質(zhì)酶的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)由內(nèi)向外存在1個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū)域（16～38 aa），N端的1～15 aa區(qū)域?yàn)榘麅?nèi)區(qū)，C端的39～217 aa區(qū)域?yàn)榘鈪^(qū)（圖5）。

2.3.3 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè) 用SignalP 4.1進(jìn)行N-乙酰胞壁質(zhì)酶的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，由圖6可以看出，該蛋白質(zhì)不包含信號(hào)肽。

2.3.4 蛋白質(zhì)的親疏水性分析 用ProtScale分析N-乙酰胞壁質(zhì)酶的親疏水性，如圖7所示，該蛋白質(zhì)氨基酸序列絕大多數(shù)為親水性殘基（正值表示疏水，負(fù)值表示親水），具有多個(gè)高親水性區(qū)域，表明該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白。

2.3.5 蛋白質(zhì)潛在的磷酸化位點(diǎn)分析 用NetPhos進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，由圖8可以看出，N-乙酰胞壁質(zhì)酶有10個(gè)絲氨酸（Ser）、9個(gè)蘇氨酸（Thr）、7個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)，可能成為蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。

2.3.6 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Hopfield HNN預(yù)測(cè) N-乙酰胞壁質(zhì)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，由圖9可以看出，該蛋白質(zhì)含有的 α- 螺旋（用h表示）占55.76%，無(wú)規(guī)則卷曲（用c表示）占32.72%，延伸鏈（用e表示）占11.52%。

2.3.7 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析 Smart軟件分析結(jié)果顯示，N-乙酰胞壁質(zhì)酶蛋白質(zhì)的16～38位氨基酸殘基是跨膜區(qū)，56～216位氨基酸殘基是LYZ2結(jié)構(gòu)域（圖10）。

2.3.8 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Phyre2軟件在線預(yù)測(cè) N-乙酰胞壁質(zhì)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，圖11結(jié)果顯示，其序列與c5t1qB模板的同源性最高，基于該模板預(yù)測(cè)的168個(gè)殘基（77%的序列）已被建模，可信度達(dá)到100%。

3 討論

乳酸菌的自溶現(xiàn)象普遍存在，大量研究表明，肽聚糖水解酶在菌體自溶中發(fā)揮著重要作用[4，9]。不同乳酸菌所含關(guān)鍵肽聚糖水解酶的種類存在差異，植物乳桿菌WCFS1和干酪乳桿菌ATCC 27092的關(guān)鍵肽聚糖水解酶是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[10-11]，而保加利亞乳桿菌LJJ的關(guān)鍵肽聚糖水解酶是N-乙酰胞壁質(zhì)酶[2]，這2種酶均是細(xì)菌中普遍存在的肽聚糖水解酶[12]。

N-乙酰胞壁質(zhì)酶俗稱溶菌酶，是一種無(wú)毒、無(wú)害、安全性很高的鹽基水解蛋白酶，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[13-15]。該酶專一性地作用于肽聚糖的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞溶解死亡。目前，已被證實(shí)能夠水解肽聚糖的溶菌酶有4類：雞蛋白溶菌酶、鵝蛋白溶菌酶、噬菌體T4溶菌酶和擬內(nèi)串生孢霉（Chalaropsis）溶菌酶，盡管這4類酶的基因序列差異很大，但它們的三維結(jié)構(gòu)顯示出一些有趣的相似性[12]。

保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質(zhì)酶的基因序列與上述酶的基因序列不同。本研究成功克隆了保加利亞乳桿菌MN株的N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因序列，該基因全長(zhǎng)654 bp，與其他保加利亞乳桿菌菌株的核苷酸同源性達(dá)到98.8%～100.0%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，其與CNCM I-1519株、LBVIB27株之間的親緣關(guān)系最近。該基因編碼217個(gè)氨基酸，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析其基因的結(jié)構(gòu)特征及編碼蛋白的功能發(fā)現(xiàn)，該蛋白的分子質(zhì)量為24 546.17 u，理論等電點(diǎn)為9.83;該基因編碼蛋白不包含信號(hào)肽，但由內(nèi)向外存在1個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū)域（16～38 aa）;該基因編碼蛋白具有多個(gè)高親水性區(qū)域，為水溶性蛋白;該基因編碼蛋白可能存在10個(gè)絲氨酸、9個(gè)蘇氨酸和7個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn);蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α-螺旋為主，且保守域56～216位氨基酸殘基是LYZ2結(jié)構(gòu)域;Phyre2軟件成功模擬出了該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，為探索該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為開(kāi)展N-乙酰胞壁質(zhì)酶基因的功能改造和保加利亞乳桿菌自溶活性的改造提供了理論依據(jù)。

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