甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列的克隆及生物信息學(xué)分析

曹輝慶 黃誠梅 蔣勝理 羅海斌 鄧智年 吳凱朝 徐林 魏源文

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成途徑的關(guān)鍵限速酶，對(duì)蔗糖的合成和碳水化合物的分配具有重要的調(diào)控作用。采用染色體步移法技術(shù)克隆獲得了甘蔗SPSB基因5′端側(cè)翼序列，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分離獲得了4 399 bp的5′側(cè)翼序列，該序列除具有啟動(dòng)子核心序列 TATA-box 和增強(qiáng)子元件 CAAT-box等典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件外，還含有多種光應(yīng)答元件、激素響應(yīng)元件，以及與缺氧、干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件，表明ScSPSB啟動(dòng)子可能具有逆境應(yīng)答、激素應(yīng)答及組織特異表達(dá)特性，值得開展進(jìn)一步的功能研究。

關(guān)鍵詞：甘蔗; ScSPSB基因;側(cè)翼序列;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)： S566.101

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0094-05

甘蔗屬高光合效率C4植物，是我國主要的糖料作物，其蔗糖產(chǎn)量占我國食糖總量的90%以上。甘蔗蔗糖積累過程是甘蔗生長發(fā)育中最重要的代謝途徑，與甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)形成密切相關(guān)。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，簡稱SPS） 作為蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性不僅能影響蔗糖的合成能力，還影響光合產(chǎn)物的分配和糖分積累[1-6]。因此，研究甘蔗SPS基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)提高甘蔗產(chǎn)量及蔗糖含量具有重要意義。

目前，已從擬南芥[7]、荔枝[8]、水稻[9]、玉米[10]、甘蔗[11]、狼尾草[12]等多種作物中克隆到SPS基因，并進(jìn)行了SPS基因家族的基因組鑒定和表達(dá)分析[7-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，植物SPS基因可分為4個(gè)家族共5種類型：SPSA（Ⅱ類）、SPSB（Ⅴ類）、SPSC（Ⅰ類）、SPSD（Ⅲ類和Ⅳ類）[13-15]，且不同植物體內(nèi)不同家族的SPS基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式和功能差異[16-21]。至今，在甘蔗中已經(jīng)鑒定出5個(gè)SPS基因家族，桂意云等對(duì)其中的4個(gè)家族SPS基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)特性分析[18]。研究表明，在甘蔗伸長期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期，SPSDⅢ基因在所有甘蔗品種的未成熟葉片、成熟葉片和莖中均高水平穩(wěn)定表達(dá);SPSB基因在成熟葉片中幾乎不表達(dá)，而以莖中表達(dá)量最高; 在蔗糖積累后期，SPSA和SPSC基因在不同組織中的表達(dá)量比蔗糖積累前期均有所下降。Verma等采用半定量RT-PCR技術(shù)，測定了不同發(fā)育階段的高、低糖甘蔗品種的節(jié)間SPS活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)成熟節(jié)間中SPS活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)均高于未成熟節(jié)間;與低糖品種相比，高糖品種在所有發(fā)育階段均表現(xiàn)出更高的SPS轉(zhuǎn)錄表達(dá)和酶活性，SPS活性與蔗糖呈正相關(guān)關(guān)系，與己糖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[19]。目前認(rèn)為SPS的活性受到植物生長發(fā)育[18-19]、光照[7，22-23]、溫度[24-25]、代謝產(chǎn)物[26]、外源物質(zhì)如激素[27]等多種因素的復(fù)雜調(diào)控，但對(duì)于SPS基因的調(diào)控機(jī)制和功能特性尚未有清楚的解析，還有待進(jìn)一步深入研究。

基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及蛋白質(zhì)加工水平等不同調(diào)節(jié)因素的控制，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是主要的。位于基因5′上游的啟動(dòng)子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的主要因素，對(duì)轉(zhuǎn)錄效率起到直接的調(diào)控作用。本研究以甘蔗新臺(tái)糖22（ROC22）為試驗(yàn)材料，在前期獲得甘蔗SPSB基因的基礎(chǔ)上，首次克隆了甘蔗SPSB基因（ScSPSB）5′側(cè)翼序列，并進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)域分析，為進(jìn)一步研究SPSB啟動(dòng)子的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗（Saccharum officinarum）栽培品種新臺(tái)糖22（ROC22）為廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室基地種植。菌種與質(zhì)粒：克隆載體pMDTM19T和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109均購于寶生物工程（大連）有限公司。主要試劑：TaKaRa Tks Gfles DNA Polymerase、TaKaRa Genome Walking kit、DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

以甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA 序列（JN584485.1）作為參考序列，甘蔗基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物擴(kuò)增SPSB DNA序列。其中正反向引物：F1：5′-GGGAAC GAGTGGATCAATGG-3′;R1：5′-GTCAGACCAGACGGTAAG GT-3′。F2：5′-AATGGGTACCTGGAGGCGAT-3′; R2：5′-TGACAGATCCTCGGCCAGGT-3′。使用50 μL反應(yīng)體系，各反應(yīng)物配比參照TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase說明書。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃ 延伸60 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用膠回收劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。純化回收目的片段與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。熱挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，由寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.3 SPSB基因5′側(cè)翼序列的克隆

采用染色體步移法技術(shù)PCR擴(kuò)增甘蔗SPSB基因5′端未知側(cè)翼序列，具體操作方法參照TaKaRa Genome Walking kit說明書。根據(jù)已經(jīng)過驗(yàn)證的序列設(shè)計(jì)3個(gè)特異性引物SP1（5′-CAAGCAGCGAGAGATTAACCGA-3′）、SP2（5′-GCCAGATCCGCCAGCACATGTT-3′）和SP3（5′-CCTCCTCG ACGAAGTAGTGCGA-3′）作為下游引物;試劑盒提供兼并引物AP1、AP2和AP3作為上游引物，甘蔗基因組DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。取第一、二、三次的PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

采用TaKaRa公司的膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，由寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.4 側(cè)翼獲取序列驗(yàn)證

根據(jù)獲取的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)引物F3：5′-CCGCGTGTGAATCGTAGAAG-3′，作為上游引物。SP1作為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 1 min;98 ℃變性 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 序列分析

采用NCBI的Blastn在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析;采用在線啟動(dòng)子分析軟件Neural Nerwork Promoter Predition（http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl）進(jìn)行核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測;采用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子區(qū)域包含的啟動(dòng)子區(qū)的核心元件。PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/） 對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

電泳結(jié)果（圖1）顯示，可以明顯擴(kuò)增到G1-PCR產(chǎn)物條帶。切膠回收G1擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，純化目的條帶連接T載體，篩選克隆測序，測序結(jié)果顯示片段大小1 388 bp，可以找到擴(kuò)增引物F1和R1，以及測序引物P1的反向互補(bǔ)序列。將片段進(jìn)行BLASTn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與已知序列的部分區(qū)域具有96.79%相似性，表明所克隆片段為甘蔗SPSB DNA片段。

2.2 染色體步移法PCR擴(kuò)增甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列

采用染色體步移法技術(shù)PCR擴(kuò)增克隆甘蔗SPSB基因5′端未知側(cè)翼序列（圖2）。切膠回收第2次巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物 AP3大小約700 bp和600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;第3次巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物AP3大小約5 000 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;第3次PCR反應(yīng)產(chǎn)物 AP4大小約1 200 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，分別使用引物SP2、SP3純化產(chǎn)物進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，將與已知序列有相關(guān)性的擴(kuò)增片段回收，連接pMDTM19T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行克隆測序。測序結(jié)果顯示片段大小為4 367 bp和 4 368 bp，可以找到擴(kuò)增引物SP3，并且測序結(jié)果的3′端具有引物SP3上游SPSB基因組序列，說明該片段是ScSPSB 5′端上游特異目的片段。將該片段進(jìn)行BLASTn比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與已知甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA序列部分區(qū)域具有9780%相似性，表明5′端獲得的未知序列是根據(jù)已知序列得到的。

2.3 側(cè)翼獲取序列驗(yàn)證及序列分析

電泳檢測結(jié)果表明，可以明顯擴(kuò)增到與預(yù)計(jì)長度大小一致的目的片段（圖3）。所擴(kuò)增片段的3′端與前述克隆的甘蔗SPSB基因DNA片段5′端序列是連續(xù)存在的。采用染色體步移法分離到了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列，序列提交GenBank，查詢登錄號(hào)MH074882，為公共數(shù)據(jù)庫首次提交的甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列。

利用http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl進(jìn)行核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在序列270～320 bp、2 458～2 508 bp、2 466～2 516 bp、3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp、3 990～4 040 bp、4 252～4 302 bp 處，預(yù)測值分別為0.97、0.84、0.98、1.00、1.00、097、0.84，預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基分別是A、C、T、C、G、A、G，3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp處為最有可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

使用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行甘蔗SPSB基因啟動(dòng)子區(qū)域分析，結(jié)果見圖4。預(yù)測結(jié)果顯示甘蔗SPSB啟動(dòng)子除包含核心啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外，還含有多種光應(yīng)答元件Sp1、MNF1、TCCC-motif、G-Box，多種激素響應(yīng)元件TGACG-motif、CGTCA-motif、ABRE，與缺氧誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件GC-motif，低溫響應(yīng)元件LIR，種子特異性調(diào)控的順式調(diào)控元件RY-element，此外還包含干旱誘導(dǎo)MYB和MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

蔗糖磷酸合成酶是植物體內(nèi)控制蔗糖生物合成的關(guān)鍵酶，起著調(diào)節(jié)蔗糖生物合成的作用。啟動(dòng)子作為基因編碼區(qū)域上游的非編碼DNA序列，在植物基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要作用[28-29]。本研究采用染色體步移法首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列，通過對(duì)SPS啟動(dòng)子區(qū)域分析，確定甘蔗SPSB啟動(dòng)子除包含核心啟動(dòng)子元件TATA-box和增強(qiáng)子元件CAAT-box外，還含有光應(yīng)答元件GT1-motif、MNF1、Sp1、TCCC-motif、G-Box，多種激素響應(yīng)元件ABRE、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、TCA-element，以及與缺氧、干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件。

目前，SPS啟動(dòng)子已在擬南芥[7，16]、水稻[30-31]、甘蔗[32-33]、番茄[34]、棉花[35]等植物中被分離并進(jìn)行功能研究。研究表明，植物SPS啟動(dòng)子上存在多種順式調(diào)控元件，如ACE、AE-box、G-Box、AT1-motif、I-box、TGACG-motif、GT1-motif和MBS等，位于SPS啟動(dòng)子區(qū)的特異調(diào)控元件調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。如SPS啟動(dòng)子上存在I-box和G-box，這是光調(diào)控基因啟動(dòng)子所必需的重要功能調(diào)控元件[36]。擬南芥SPS啟動(dòng)子研究表明光照對(duì)SPS基因的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控至關(guān)重要[30]。與干旱誘導(dǎo)有關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）也存在于SPS啟動(dòng)子中，這在擬南芥滲透脅迫誘導(dǎo)SPS基因研究中已有報(bào)道[16]。番茄SPS啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測存在多種順式調(diào)控元件：光響應(yīng)元件ACE、G-box、AE-box、as-2-box，參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeats、HSE，激素反應(yīng)元件ABRE、GARE-motif等，通過啟動(dòng)子活性的瞬時(shí)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在番茄的所有組織中均有表達(dá)，并受光照、應(yīng)激和激素反應(yīng)的調(diào)控[34]。

SPS是一個(gè)多基因家族，植物體內(nèi)不同家族SPS基因的表達(dá)模式和調(diào)控模式各不相同[20-21，37]。關(guān)于甘蔗SPS基因啟動(dòng)子研究主要集中于SPSⅢ（A家族）啟動(dòng)子的研究。在甘蔗SPSⅢ（A家族）啟動(dòng)子研究中發(fā)現(xiàn)SPSⅢ啟動(dòng)子區(qū)上除了存在典型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)外，還存在多種光響應(yīng)元件ATCT-motif、ACE、AE-box、G-Box和一些與分生組織、芽組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件CAT-box、as-2-box，但未見本研究SPSB啟動(dòng)子所包含的激素響應(yīng)元件和干旱、低溫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件[32-33]。這可能在一定程度上詮釋了同一植物不同家族SPS基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制不同。

本研究首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列，并進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)域分析。分析表明甘蔗SPSB基因5′側(cè)翼序列含有典型的啟動(dòng)子核心元件和多種順式調(diào)控元件。結(jié)合已有研究基礎(chǔ)，根據(jù)分析結(jié)果推測甘蔗SPSB基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能在一定程度上受組織生長發(fā)育、光照、激素、逆境脅迫等多種因素調(diào)控。要弄清SPSB基因的調(diào)控機(jī)制和功能，還須進(jìn)一步研究論證。

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