甘蔗SPSB基因5′側翼序列的克隆及生物信息學分析

曹輝慶 黃誠梅 蔣勝理 羅海斌 鄧智年 吳凱朝 徐林 魏源文

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成途徑的關鍵限速酶，對蔗糖的合成和碳水化合物的分配具有重要的調(diào)控作用。采用染色體步移法技術克隆獲得了甘蔗SPSB基因5′端側翼序列，并對其序列進行生物信息學分析。分離獲得了4 399 bp的5′側翼序列，該序列除具有啟動子核心序列 TATA-box 和增強子元件 CAAT-box等典型的真核生物啟動子基本元件外，還含有多種光應答元件、激素響應元件，以及與缺氧、干旱、低溫誘導有關的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達有關的順式調(diào)控元件，表明ScSPSB啟動子可能具有逆境應答、激素應答及組織特異表達特性，值得開展進一步的功能研究。

關鍵詞：甘蔗; ScSPSB基因;側翼序列;生物信息學分析

中圖分類號： S566.101

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0094-05

甘蔗屬高光合效率C4植物，是我國主要的糖料作物，其蔗糖產(chǎn)量占我國食糖總量的90%以上。甘蔗蔗糖積累過程是甘蔗生長發(fā)育中最重要的代謝途徑，與甘蔗產(chǎn)量和品質形成密切相關。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，簡稱SPS） 作為蔗糖代謝途徑中的關鍵限速酶，其活性不僅能影響蔗糖的合成能力，還影響光合產(chǎn)物的分配和糖分積累[1-6]。因此，研究甘蔗SPS基因的表達調(diào)控機制對提高甘蔗產(chǎn)量及蔗糖含量具有重要意義。

目前，已從擬南芥[7]、荔枝[8]、水稻[9]、玉米[10]、甘蔗[11]、狼尾草[12]等多種作物中克隆到SPS基因，并進行了SPS基因家族的基因組鑒定和表達分析[7-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，植物SPS基因可分為4個家族共5種類型：SPSA（Ⅱ類）、SPSB（Ⅴ類）、SPSC（Ⅰ類）、SPSD（Ⅲ類和Ⅳ類）[13-15]，且不同植物體內(nèi)不同家族的SPS基因表現(xiàn)出不同的表達模式和功能差異[16-21]。至今，在甘蔗中已經(jīng)鑒定出5個SPS基因家族，桂意云等對其中的4個家族SPS基因進行了時空表達特性分析[18]。研究表明，在甘蔗伸長期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期，SPSDⅢ基因在所有甘蔗品種的未成熟葉片、成熟葉片和莖中均高水平穩(wěn)定表達;SPSB基因在成熟葉片中幾乎不表達，而以莖中表達量最高; 在蔗糖積累后期，SPSA和SPSC基因在不同組織中的表達量比蔗糖積累前期均有所下降。Verma等采用半定量RT-PCR技術，測定了不同發(fā)育階段的高、低糖甘蔗品種的節(jié)間SPS活性及轉錄表達水平，發(fā)現(xiàn)成熟節(jié)間中SPS活性和轉錄表達均高于未成熟節(jié)間;與低糖品種相比，高糖品種在所有發(fā)育階段均表現(xiàn)出更高的SPS轉錄表達和酶活性，SPS活性與蔗糖呈正相關關系，與己糖呈負相關關系[19]。目前認為SPS的活性受到植物生長發(fā)育[18-19]、光照[7，22-23]、溫度[24-25]、代謝產(chǎn)物[26]、外源物質如激素[27]等多種因素的復雜調(diào)控，但對于SPS基因的調(diào)控機制和功能特性尚未有清楚的解析，還有待進一步深入研究。

基因的表達受轉錄水平、翻譯水平及蛋白質加工水平等不同調(diào)節(jié)因素的控制，其中轉錄水平的調(diào)控是主要的。位于基因5′上游的啟動子被認為是調(diào)節(jié)基因轉錄的主要因素，對轉錄效率起到直接的調(diào)控作用。本研究以甘蔗新臺糖22（ROC22）為試驗材料，在前期獲得甘蔗SPSB基因的基礎上，首次克隆了甘蔗SPSB基因（ScSPSB）5′側翼序列，并進行了啟動子區(qū)域分析，為進一步研究SPSB啟動子的生物學功能提供了基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗（Saccharum officinarum）栽培品種新臺糖22（ROC22）為廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室基地種植。菌種與質粒：克隆載體pMDTM19T和大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109均購于寶生物工程（大連）有限公司。主要試劑：TaKaRa Tks Gfles DNA Polymerase、TaKaRa Genome Walking kit、DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

以甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA 序列（JN584485.1）作為參考序列，甘蔗基因組DNA為模板，設計了2對特異性引物擴增SPSB DNA序列。其中正反向引物：F1：5′-GGGAAC GAGTGGATCAATGG-3′;R1：5′-GTCAGACCAGACGGTAAG GT-3′。F2：5′-AATGGGTACCTGGAGGCGAT-3′; R2：5′-TGACAGATCCTCGGCCAGGT-3′。使用50 μL反應體系，各反應物配比參照TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase說明書。PCR反應程序：94 ℃預變性1 min;98 ℃變性10 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃ 延伸60 s，30個循環(huán)。反應結束后，擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用膠回收劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進行回收和純化。純化回收目的片段與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞。熱挑取陽性菌落，提取質粒，由寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.3 SPSB基因5′側翼序列的克隆

采用染色體步移法技術PCR擴增甘蔗SPSB基因5′端未知側翼序列，具體操作方法參照TaKaRa Genome Walking kit說明書。根據(jù)已經(jīng)過驗證的序列設計3個特異性引物SP1（5′-CAAGCAGCGAGAGATTAACCGA-3′）、SP2（5′-GCCAGATCCGCCAGCACATGTT-3′）和SP3（5′-CCTCCTCG ACGAAGTAGTGCGA-3′）作為下游引物;試劑盒提供兼并引物AP1、AP2和AP3作為上游引物，甘蔗基因組DNA為模板，進行巢式PCR反應。取第一、二、三次的PCR產(chǎn)物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

采用TaKaRa公司的膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收和純化。膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取陽性菌落，提取質粒，由寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.4 側翼獲取序列驗證

根據(jù)獲取的側翼序列，設計引物F3：5′-CCGCGTGTGAATCGTAGAAG-3′，作為上游引物。SP1作為下游引物，進行PCR擴增。PCR反應程序：94 ℃預變性 1 min;98 ℃變性 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30個循環(huán)。反應結束后，擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 序列分析

采用NCBI的Blastn在線軟件進行序列比對分析;采用在線啟動子分析軟件Neural Nerwork Promoter Predition（http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl）進行核心啟動子和轉錄起始位點預測;采用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子區(qū)域包含的啟動子區(qū)的核心元件。PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/） 對啟動子區(qū)域進行分析。

2 結果與分析

2.1 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

電泳結果（圖1）顯示，可以明顯擴增到G1-PCR產(chǎn)物條帶。切膠回收G1擴增產(chǎn)物條帶，純化目的條帶連接T載體，篩選克隆測序，測序結果顯示片段大小1 388 bp，可以找到擴增引物F1和R1，以及測序引物P1的反向互補序列。將片段進行BLASTn比對，發(fā)現(xiàn)該序列與已知序列的部分區(qū)域具有96.79%相似性，表明所克隆片段為甘蔗SPSB DNA片段。

2.2 染色體步移法PCR擴增甘蔗SPSB基因5′側翼序列

采用染色體步移法技術PCR擴增克隆甘蔗SPSB基因5′端未知側翼序列（圖2）。切膠回收第2次巢式PCR反應產(chǎn)物 AP3大小約700 bp和600 bp的擴增產(chǎn)物條帶;第3次巢式PCR反應產(chǎn)物AP3大小約5 000 bp的擴增產(chǎn)物條帶;第3次PCR反應產(chǎn)物 AP4大小約1 200 bp的擴增產(chǎn)物條帶，分別使用引物SP2、SP3純化產(chǎn)物進行測序。根據(jù)測序結果，將與已知序列有相關性的擴增片段回收，連接pMDTM19T載體并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，篩選陽性菌落，提取質粒，進行克隆測序。測序結果顯示片段大小為4 367 bp和 4 368 bp，可以找到擴增引物SP3，并且測序結果的3′端具有引物SP3上游SPSB基因組序列，說明該片段是ScSPSB 5′端上游特異目的片段。將該片段進行BLASTn比對，發(fā)現(xiàn)其與已知甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA序列部分區(qū)域具有9780%相似性，表明5′端獲得的未知序列是根據(jù)已知序列得到的。

2.3 側翼獲取序列驗證及序列分析

電泳檢測結果表明，可以明顯擴增到與預計長度大小一致的目的片段（圖3）。所擴增片段的3′端與前述克隆的甘蔗SPSB基因DNA片段5′端序列是連續(xù)存在的。采用染色體步移法分離到了甘蔗SPSB基因5′側翼序列，序列提交GenBank，查詢登錄號MH074882，為公共數(shù)據(jù)庫首次提交的甘蔗SPSB基因5′側翼序列。

利用http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl進行核心啟動子和轉錄起始位點預測。結果發(fā)現(xiàn)在序列270～320 bp、2 458～2 508 bp、2 466～2 516 bp、3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp、3 990～4 040 bp、4 252～4 302 bp 處，預測值分別為0.97、0.84、0.98、1.00、1.00、097、0.84，預測的轉錄起始位點的堿基分別是A、C、T、C、G、A、G，3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp處為最有可能的轉錄起始位點。

使用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行甘蔗SPSB基因啟動子區(qū)域分析，結果見圖4。預測結果顯示甘蔗SPSB啟動子除包含核心啟動子元件TATA-box和CAAT-box外，還含有多種光應答元件Sp1、MNF1、TCCC-motif、G-Box，多種激素響應元件TGACG-motif、CGTCA-motif、ABRE，與缺氧誘導有關的順式作用元件GC-motif，低溫響應元件LIR，種子特異性調(diào)控的順式調(diào)控元件RY-element，此外還包含干旱誘導MYB和MYBHv1結合位點。

3 討論與結論

蔗糖磷酸合成酶是植物體內(nèi)控制蔗糖生物合成的關鍵酶，起著調(diào)節(jié)蔗糖生物合成的作用。啟動子作為基因編碼區(qū)域上游的非編碼DNA序列，在植物基因表達調(diào)控過程中起著重要作用[28-29]。本研究采用染色體步移法首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側翼序列，通過對SPS啟動子區(qū)域分析，確定甘蔗SPSB啟動子除包含核心啟動子元件TATA-box和增強子元件CAAT-box外，還含有光應答元件GT1-motif、MNF1、Sp1、TCCC-motif、G-Box，多種激素響應元件ABRE、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、TCA-element，以及與缺氧、干旱、低溫誘導有關的順式作用元件和一些組織調(diào)控表達有關的順式調(diào)控元件。

目前，SPS啟動子已在擬南芥[7，16]、水稻[30-31]、甘蔗[32-33]、番茄[34]、棉花[35]等植物中被分離并進行功能研究。研究表明，植物SPS啟動子上存在多種順式調(diào)控元件，如ACE、AE-box、G-Box、AT1-motif、I-box、TGACG-motif、GT1-motif和MBS等，位于SPS啟動子區(qū)的特異調(diào)控元件調(diào)控基因的轉錄表達。如SPS啟動子上存在I-box和G-box，這是光調(diào)控基因啟動子所必需的重要功能調(diào)控元件[36]。擬南芥SPS啟動子研究表明光照對SPS基因的表達以及轉錄后調(diào)控至關重要[30]。與干旱誘導有關的MYB結合位點（MBS）也存在于SPS啟動子中，這在擬南芥滲透脅迫誘導SPS基因研究中已有報道[16]。番茄SPS啟動子區(qū)域預測存在多種順式調(diào)控元件：光響應元件ACE、G-box、AE-box、as-2-box，參與防御和應激反應的順式作用元件TC-rich repeats、HSE，激素反應元件ABRE、GARE-motif等，通過啟動子活性的瞬時表達分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子在番茄的所有組織中均有表達，并受光照、應激和激素反應的調(diào)控[34]。

SPS是一個多基因家族，植物體內(nèi)不同家族SPS基因的表達模式和調(diào)控模式各不相同[20-21，37]。關于甘蔗SPS基因啟動子研究主要集中于SPSⅢ（A家族）啟動子的研究。在甘蔗SPSⅢ（A家族）啟動子研究中發(fā)現(xiàn)SPSⅢ啟動子區(qū)上除了存在典型啟動子結構外，還存在多種光響應元件ATCT-motif、ACE、AE-box、G-Box和一些與分生組織、芽組織特異性表達相關的順式調(diào)控元件CAT-box、as-2-box，但未見本研究SPSB啟動子所包含的激素響應元件和干旱、低溫誘導有關的順式作用元件[32-33]。這可能在一定程度上詮釋了同一植物不同家族SPS基因表達模式及調(diào)控機制不同。

本研究首次分離克隆了甘蔗SPSB基因5′側翼序列，并進行了啟動子區(qū)域分析。分析表明甘蔗SPSB基因5′側翼序列含有典型的啟動子核心元件和多種順式調(diào)控元件。結合已有研究基礎，根據(jù)分析結果推測甘蔗SPSB基因的轉錄表達可能在一定程度上受組織生長發(fā)育、光照、激素、逆境脅迫等多種因素調(diào)控。要弄清SPSB基因的調(diào)控機制和功能，還須進一步研究論證。

參考文獻：

[1]Hashida Y，Hirose T，Okamura M，et al. A reduction of sucrose phosphate synthase （SPS） activity affects sucrose/starch ratio in leaves but does not inhibit normal plant growth in rice[J]. Plant science，2016，253：40-49.

[2]Winter H，Huber S C. Regulation of sucrose metabolism in higher plants：localization and regulation of activity of key enzymes[J]. Plant Sciences，2000，19（1）：31-67.

[3]Seger M，Gebril S，Tabilona J，et al. Impact of concurrent overexpression of cytosolic glutamine synthetase （GS1） and sucrose phosphate synthase （SPS） on growth and development in transgenic tobacco[J]. Planta，2015，241（1）：69-81.

[4]Batta S K，Thind D K，Singh P，et al. Variability in activities of sucrose metabolizing enzymes in relation to sucrose accumulation among parents and their progenies of sugarcane[J]. Sugar Tech，2011，13（2）：114-122.

[5]Sachdeva M，Bhatia S，Batta S K. Sucrose accumulation in sugarcane：a potential target for crop improvement[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2011，33（5）：1571-1583.

[6]潘有強，羅海玲，李楊瑞. 甘蔗節(jié)間蔗糖含量與和蔗糖代謝相關的4種酶活性之間的關系剖析[J]. 植物生理學通訊，2007，43（5）：861-864.

[7]Volkert K，Debast S，Voll L M，et al. Loss of the two major leaf isoforms of sucrose-phosphate synthase in Arabidopsis thaliana limits sucrose synthesis and nocturnal starch degradation but does not alter carbon partitioning during photosynthesis[J]. Journal of experimental botany，2014，65（18）：5217-5229.

[8]Wang D，Zhao J T，Hu B，et al. Identification and expression profile analysis of the sucrose phosphate synthase gene family in Litchi chinensis Sonn[J]. PeerJ，2018，6：1-16.

[9]Valdez-Alarcon J J，F(xiàn)errando M，Salerno G，et al. Characterization of a rice sucrose-phosphate synthase-encoding gene[J]. Gene，1996，170（2）：217-222.

[10]李 瑩，劉寶輝，張中男，等. 玉米蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的克隆及表達載體的構建[J]. 生物信息學，2005（2）：66-68，72.

[11]Sugiharto B，Sakakibara H，Sumadi，et al. Differential expression of two genes for sucrose-phosphate synthase in sugarcane：Molecular cloning of the cDNAs and comparative analysis of gene expression[J]. Plant and Cell Physiology，1997，38（8）：961-965.

[12]Li H C，Lu H B，Yang F Y，et al. Cloning and sequence analysis of sucrose phosphate synthase gene from varieties of Pennisetum species[J]. Genetics and Molecular Research，2015，14（1）：2799-2808.

[13]Castleden C K，Aoki N，Gillespie V J，et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses[J]. Plant Physiology，2004，135（3）：1753-1764.

[14]Langenkamper G，F(xiàn)ung R W，Newcomb R D，et al. Sucrose phosphate synthase genes in plants belong to three different families[J]. Journal of Molecular Evolution，2002，54（3）：322-332.

[15]黃東亮，李雙喜，廖 青，等. 植物蔗糖磷酸合成酶研究進展[J]. 中國生物工程雜志，2012，32（6）：109-119.

[16]Solis-Guzman M G，Arguello-Astorg G，Lopez-Bucio J，et al. Arabidopsis thaliana sucrose phosphate synthase （SPS） genes are expressed differentially in organs and tissues，and their transcription is regulated by osmotic stress[J]. Gene Expression Patterns，2017，25-26：92-101.

[17]Reimholz R，Geiger M，Haake V，et al. Potato plants contain multiple forms of sucrose phosphate synthase，which differ in their tissue distributions，their levels during development，and their responses to low temperature[J]. Plant Cell and Environment，1997，20（3）：291-305.

[18]桂意云，汪 淼，秦翠鮮，等. 甘蔗各家族SPS基因表達特性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2016，47（2）：174-179.

[19]Verma A K，Upadhyay S K，Verma P C，et al. Functional analysis of sucrose phosphate synthase （SPS） and sucrose synthase （SS） in sugarcane （Saccharum） cultivars[J]. Plant Biology，2011，13（2）：325-332.

[20]陳蘭平，陳由強，方靜平，等. 甘蔗SPS基因家族成員表達與糖分積累關系解析[J]. 熱帶作物學報，2014，35（7）：1354-1361.

[21]ElSayed A I，Boulila M，Rafudeen M S. Investigation into the expression of sucrose transporters and sucrose phosphate synthase mRNA in different plant species[J]. Agricultural Research，2013，2（1）：31-42.

[22]Sicher R C，Kremer D F. Changes of sucrose-phosphate synthase activity in barley primary leaves during light/dark transitions[J]. Plant Physiology，1984，76（4）：910-912.

[23]Chen S，Hajirezaei M，Bornke F. Differential expression of sucrose-phosphate synthase isoenzymes in tobacco reflects their functional specialization during dark-governed starch mobilization in source leaves[J]. Plant Physiology，2005，139（3）：1163-1174.

[24]Guy C L，Huber J L A，Huber S C. Sucrose phosphate synthase and sucrose accumulation at low temperature[J]. Plant physiology，1992，100（1）：502-508.

[25]Itai A，Hatanaka R，Irie H，et al. Effects of storage temperature on fruit quality and expression of sucrose phosphate synthase and acid invertase genes in Japanese pear[J]. Horticulture Journal，2015，84（3）：227-232.

[26]Doehlert D C，Huber S C. Spinach leaf sucrose phosphate synthase[J]. FEBS Letters，1983，153（2）：293-297.

[27]Sakalo V D，Kurchii V M. Hormonal control of sucrose phosphate synthase and sucrose synthase in sugar beet[J]. Russian Journal of Plant Physiology，2004，51（2）：183-188.

[28]Dare A P，Schaffer R J，Lin-Wang K，et al. Identification of a cis-regulatory element by transient analysis of co-ordinately regulated genes[J]. Plant Methods，2008，4（17）：1-10.

[29]王旭明，趙夏夏，陳景陽，等. 鹽脅迫下水稻孕穗期SS和SPS活性與糖積累的響應及其相關性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2018，34（3）：481-486.

[30]Hirose T，Hashida Y，Aoki N，et al. Analysis of gene-disruption mutants of a sucrose phosphate synthase gene in rice，OsSPS1，shows the importance of sucrose synthesis in pollen germination[J]. Plant Science，2014，225：102-106.

[31]Yonekura M，Aoki N，Hirose T，et al. The promoter activities of sucrose phosphate synthase genes in rice，OsSPS1 and OsSPS11，are controlled by light and circadian clock，but not by sucrose[J]. Frontiers in Plant Science，2013（4）：31.

[32]張積森，鄭月霞，方靜平，等. 甘蔗SPSⅢ基因啟動子5′側翼缺失的GUS表達載體構建[J]. 福建教育學院學報，2012（3）：118-121.

[33]高玉娜，林榮華，周 平，等. 甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因啟動子遺傳轉化煙草的研究[J]. 福建師范大學學報（自然科學版），2010，26（1）：100-102，119.

[34]Naqvi R Z，Mubeen，H，et al. Identification，isolation and evaluation of a constitutive sucrose phosphate synthase gene promoter from tomato[J]. Pakistan Journal of Botany，2017，49（3）：1105-1112.

[35]Nadia I，Muhammad A，Amara M，et al. Isolation and characterization of sucrose phosphate synthase promoter from cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Australian Journal of Crop Science，2017，11（6）：668-675.

[36]Arguello-Astorga G R，Herrera-Estrella L R. Ancestral multipartite units in light-responsive plant promoters have structural features correlating with specific phototransduction pathways[J]. Plant Physiology，1996，112（3）：1151-1166.

[37]張 莉，薦紅舉，楊 博，等. 甘藍型油菜蔗糖磷酸合酶（SPS）基因家族成員鑒定及表達分析[J]. 作物學報，2018（2）：1-11.蘇文政，吳家強，馬建軍，等. 保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質酶基因的克隆及生物信息學分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（15）：99-102.