豬IgG1-Fc基因的克隆、原核表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

連凱琪 周玲玲 王英杰 李翠 宋玉偉 張明亮

摘要：為了探索豬IgG1-Fc（pIgG1-Fc）基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，首先通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增 pIgG1-Fc 基因，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a（+）-pIgG1-Fc，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)，然后通過優(yōu)化異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)濃度、菌體培養(yǎng)溫度及菌體培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)pIgG1-Fc重組蛋白的高效表達(dá)。結(jié)果表明，成功克隆了pIgG1-Fc的基因666 bp，共編碼222個(gè)氨基酸;重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a（+）-pIgG1-Fc經(jīng)過酶切和測(cè)序證明構(gòu)建正確，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中能夠表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量約為36 ku。其最佳表達(dá)條件如下：在25 ℃條件下加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h可形成大量包涵體蛋白。pIgG1-Fc基因被成功克隆并原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能及實(shí)現(xiàn)其他蛋白與pIgG1-Fc融合后原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，為制備能與豬IgG1結(jié)合的二抗提供了材料。

關(guān)鍵詞：Fc;原核表達(dá);包涵體;融合蛋白

中圖分類號(hào)： S858.28;Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0091-03

自20世紀(jì)末多克隆抗體出現(xiàn)以來，相繼出現(xiàn)了雜交瘤單克隆抗體和基因工程抗體。當(dāng)前，抗體相關(guān)技術(shù)在疾病診斷、藥物靶向性治療、免疫預(yù)防、抗體融合蛋白制藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1-3]。其中，與宿主主要免疫球蛋白恒定區(qū)中Fc片段（CH2和CH3功能區(qū)）共同表達(dá)的融合蛋白被很多科研人員關(guān)注，如疫苗開發(fā)、新藥物研制等[4-5]。前期更多的研究者都是對(duì)Fc及其融合蛋白進(jìn)行真核表達(dá)，以期實(shí)現(xiàn)Fc的功能活性，但是真核表達(dá)量均較低，成本比較高，限制了Fc融合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。相關(guān)文獻(xiàn)也表明，一些人源Fc融合蛋白已實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性[6-7]。因此，本研究擬克隆豬IgG1的Fc基因（pIgG1-Fc），并進(jìn)行原核表達(dá)，然后對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）濃度、表達(dá)溫度和表達(dá)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)融合蛋白表達(dá)的可溶性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究pIgG1-Fc融合蛋白的原核表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pET30a（+）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），由安陽工學(xué)院河南省動(dòng)物疫病防控與營養(yǎng)免疫院士工作站保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增酶，均購自大連寶生物工程公司;酵母抽提物、胰蛋白胨、異丙基硫代半乳糖苷，購自Solarbio生物公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購自O(shè)mega Bio-tek。PCR引物合成和DNA測(cè)序，均由金維智生物科技有限公司完成。

1.3 pIgG1-Fc基因的克隆

在安陽工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室取豬的脾臟組織和由外周血分離的細(xì)胞研磨、按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，作為擴(kuò)增pIgG1-Fc基因的模板。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的pIgG1-Fc基因序列，設(shè)計(jì)引物并引入2個(gè)酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，F(xiàn)c-F：5′-CGCGGATCCCCCATATGCCCAGGCTGTG-3′（帶下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），F(xiàn)c-R：5′-TCCCAAGCTTGTTTACCCTGAGTCTTGGAG-3′（帶下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)），該對(duì)引物擴(kuò)增片段大小約為 666 bp，引物送金維智生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中：Premix Taq 25 μL，上、下游引物（濃度 10 pmol/L）各1 μL，cDNA模板2 μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)至 50 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 4 min; 95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠并純化。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

膠回收純化的pIgG1-Fc基因片段和載體pET30a（+）均被BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后回收，將回收的目的片段和載體片段按一定的比例在T4 DNA連接酶的作用下于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，37 ℃ 溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆置于37 ℃搖菌12～16 h，提取質(zhì)粒，將雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送金維智生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂布含有卡那霉素的LB瓊脂平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落搖菌過夜，將菌液分別按 1 ∶ 100 的比例接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h后，將每管菌液平均分成2管，1管加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol/L，另一管不加IPTG作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)置 pET30a（+） 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。將加入IPTG組和對(duì)照組菌液都放入37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，然后于 12 000 r/min 離心1 min，棄上清，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸菌體沉淀，取 80 μL 加入20 μL 5×loading buffer沸水煮 10 min 制備樣品，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.6 重組蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化

1.6.1 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將上述過夜培養(yǎng)的陽性菌液按1 ∶ 100的比例接種于含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng) 4 h，分別加入IPTG至終濃度為0、0.1、0.3、0.5、0.7、09、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)置pET30a（+）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。參照“1.5”節(jié)進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.2 表達(dá)溫度的優(yōu)化 將上述過夜培養(yǎng)的陽性菌液按 1 ∶ 100 的比例接種于含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別于16、20、25、30、37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)置pET30a（+）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。參照“1.5”節(jié)方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.3 表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化 將上述過夜培養(yǎng)的陽性菌液按 1 ∶ 100 的比例接種于含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25 ℃分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3、4、5、6、7 h，同時(shí)設(shè)置pET30a（+）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。參照“1.5”節(jié)進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白可溶性表達(dá)分析

將“1.5”節(jié)過夜培養(yǎng)的陽性菌液按1 ∶ 100的比例接種于100 mL含卡那霉素的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h，然后于 12 000 r/min 離心1 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀洗2次，加入10 mL PBS重懸沉淀，置于冰上進(jìn)行超聲，工作3 s，間歇 3 s，超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液80 μL，用100 μL PBS重懸沉淀后也取80 μL，分別加入20 μL 5×loading buffer沸水煮10 min制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pIgG1-Fc基因克隆

通過反轉(zhuǎn)錄和PCR特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段大小約為666 bp，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，PCR擴(kuò)增基因?yàn)?pIgG1-Fc。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒分別用PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增條帶單一，大小約為666 bp，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切也出現(xiàn)1條約666 bp大小的條帶（圖2），測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒pET30a（+）-pIgG1-Fc構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，可見相對(duì)分子量約為36.0 ku的特異性蛋白條帶，pET30a（+） 空載體表達(dá)對(duì)照組沒有出現(xiàn)目的條帶（圖3）。

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）在IPTG終濃度為1 mmol/L、37 ℃ 下誘導(dǎo)表達(dá)4 h時(shí)，重組蛋白pIgG1-Fc的表達(dá)量最高（圖4）。

2.4.2 最佳表達(dá)溫度的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）在IPTG終濃度為1 mmol/L、25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)4 h時(shí)，重組蛋白pIgG1-Fc的表達(dá)量最高（圖5）。

2.4.3 最佳表達(dá)時(shí)間的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)

化的大腸桿菌BL21（DE3）在IPTG終濃度為1 mmol/L、25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí)，重組蛋白pIgG1-Fc的表達(dá)量最高（圖6）。

2.5 重組蛋白可溶性表達(dá)鑒定

pET30a（+）-pIgG1-Fc轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）在IPTG終濃度為1 mmol/L、25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí)，重組pIgG1-Fc蛋白既在包涵體中表達(dá)也在上清中表達(dá)，但主要在包涵體中表達(dá)（圖7）。

3 討論

Fc段作為免疫球蛋白的恒定區(qū)，由物種決定。外源蛋白通過與免疫球蛋白Fc段結(jié)合形成融合蛋白可延緩靶蛋白在機(jī)體內(nèi)的降解，F(xiàn)c與免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合的功能也可加強(qiáng)遞呈靶蛋白給免疫細(xì)胞、介導(dǎo)融合蛋白穿過胎盤和黏膜屏障、促進(jìn)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用及調(diào)控抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)

的細(xì)胞毒作用等多種生物學(xué)效應(yīng)[5，8-11]。人源Fc段形成多種融合蛋白已被大量研究[12-13]，動(dòng)物源Fc段形成的融合蛋白近些年來也逐漸被關(guān)注[14-15]，但大多以真核表達(dá)為主，豬源Fc片段的原核表達(dá)在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本研究首先克隆了豬IgG1-Fc片段基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a（+）-pIgG1-Fc。在確定該重組質(zhì)粒能夠原核表達(dá)后，又對(duì)原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定該重組質(zhì)粒在IPTG終濃度為1 mmol/L、25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h時(shí)，重組蛋白pIgG1-Fc的表達(dá)量最高。最后鑒定該融合蛋白的表達(dá)不僅存在于上清中，也存在于包涵體中，且主要以包涵體形式表達(dá)。該表達(dá)所用原核表達(dá)載體為pET30a（+），是常用的原核表達(dá)載體之一，帶有組氨酸標(biāo)簽可用于鎳柱純化融合蛋白。該載體含有腸激酶作用位點(diǎn)，可用于融合蛋白純化后去除標(biāo)簽等多余氨基酸，表明重組蛋白可方便地用于后續(xù)研究。

本研究對(duì)豬IgG1-Fc基因的成功克隆和原核表達(dá)，為后續(xù)研究IgG1-Fc融合蛋白的原核表達(dá)，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大量生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)，為研究能與豬IgG1結(jié)合的二抗提供了抗原材料。

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