基于碳點(diǎn)的即時(shí)測(cè)試方法的研究進(jìn)展

高家樂(lè) ,鈕 冰 ,陳 沁* ,王 艷

(1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.上海海關(guān) 動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)

隨著各領(lǐng)域行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的升級(jí),檢測(cè)已經(jīng)不可或缺。面對(duì)海量的檢測(cè)需求、極短的檢測(cè)時(shí)限,傳統(tǒng)方法檢測(cè)緩慢、要求高、操作復(fù)雜的短板已經(jīng)越來(lái)越難以適應(yīng),新一代更快、更好、更方便的檢測(cè)技術(shù)亟待研發(fā)。即時(shí)測(cè)試(PoCT)具有短耗時(shí)、高集成、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)又能保證準(zhǔn)確度和一定的敏感度,在食品、檢疫、醫(yī)療等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。近年來(lái),許多納米材料被用于一種全新的納米PoCT 方法,碳點(diǎn)(CDs)的應(yīng)用就是其中之一。

CDs是一類新型的納米材料,通常是小于10 nm 的零維納米材料,一般都具有光致發(fā)光的特性[1]。CDs是由sp2和sp3碳原子組成的碳核,通常伴隨其碳化程度的不同呈現(xiàn)出石墨晶格或者無(wú)固定形狀的結(jié)構(gòu)形式[2]。CDs的共價(jià)碳骨架結(jié)構(gòu)是其穩(wěn)定性的重要保障,為CDs的功能化提供了可能。CDs的表面可以通過(guò)化學(xué)修飾附上大量官能團(tuán)如羧基、羥基、胺基等[3],也可以吸附聚合物鏈如核酸等[2]。CDs具有優(yōu)異的光學(xué)特性、抗菌活性、生物相容性和生物安全性[4],在體內(nèi)外測(cè)試中被廣泛使用。

本工作就CDs各種獨(dú)特的性質(zhì)綜述了其在生物檢測(cè)方向的應(yīng)用,為開發(fā)靈活、廣泛的納米材料PoCT 平臺(tái)提供信息。

1 可用于核酸檢測(cè)的CDs制備和表征

1.1 CDs的制備

CDs可通過(guò)多種方法制備,不同的制備方法決定了CDs的微觀結(jié)構(gòu)、大小和量子產(chǎn)率。CDs的來(lái)源豐富,除了活性炭、石墨等物質(zhì)以外,含碳無(wú)機(jī)物如檸檬酸鈉和碳酸氫銨也能夠高效率地制備CDs。以食物為碳源的食源性CDs 也常常受到關(guān)注。QIN 等[5]以面粉為原料,微波輔助快速、綠色制備CDs,將Hg2＋的檢出限進(jìn)一步下降至0.5 nmol·L－1;YAVUZ 等[6]由甜菜糖蜜制備CDs,粒徑為1.3～3.8 nm;WANG 等[7]以大豆為原料制備了藍(lán)色熒光CDs,量子產(chǎn)率為4.46%;JOTHI等[8]使用米糠制備了自鈍化的亮綠色熒光CDs,量子產(chǎn)率為7.4%。

CDs的制備一般分為自上而下和自下而上兩種方法。自上而下的方法是指含碳材料通過(guò)物理或化學(xué)的方法被分解成納米級(jí)碎片的過(guò)程,而自下而上的方法是指將小的有機(jī)分子碳化或者小的芳香族化合物逐步組合而成CDs[1]。

1.1.1 自上而下的制備方法

CDs的自上而下制備方法通常是以碳納米管、碳纖維、石墨、活性炭等宏觀含碳物質(zhì)為原料[9-11],通過(guò)物理或化學(xué)方法分解至納米級(jí)而得到。由于分解物質(zhì)所需條件苛刻,反應(yīng)常在高熱、強(qiáng)酸等極端環(huán)境下發(fā)生,制備過(guò)程較為繁瑣。2004年,XU 等[12]在對(duì)熒光單壁碳納米管(SWCNT)的碎片進(jìn)行電泳分析和純化時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)了一種熒光碳雜質(zhì),并首次提出了CDs這種納米尺度的物質(zhì)有望作為新的納米材料而得到應(yīng)用。他們通過(guò)電弧放電法從SWCNT的粗煙灰中分離得到CDs,但此種方法得到的CDs 難以純化,量子產(chǎn)率也不是很高[10]。2006年,SUN 等[13]通過(guò)激光燒蝕法(LA)制備了熒光CDs,該方法可以產(chǎn)生較為純凈的CDs,量子產(chǎn)率也提高至4%～10%。產(chǎn)生的熒光CDs在固定激發(fā)波長(zhǎng)的光照下能夠呈現(xiàn)多種波長(zhǎng)的發(fā)射光,該方法也逐漸成為目前常用的CDs自上而下制備方法。2020年,KANG 等[14]使用脈沖LA 一步制備摻硫石墨烯量子點(diǎn),這種CDs的量子產(chǎn)率為3.89%,光學(xué)性能得到了很大的提升。CALABRO 等[15]通過(guò)液相LA 制備石墨烯量子點(diǎn),并與化學(xué)氧化法進(jìn)行了比較,認(rèn)為液相LA 能夠減少化學(xué)藥品用量,且副產(chǎn)物較少,從而使更快、更綠色制備石墨烯量子點(diǎn)成為可能。

電化學(xué)或化學(xué)制備法能在保證一定量子產(chǎn)率的條件下,實(shí)現(xiàn)CDs的表面功能化。在常壓和常溫下,CDs可通過(guò)強(qiáng)氧化劑以氧化還原反應(yīng)的方式制備,這樣的制備方式能在一定程度上控制CDs的顆粒大小,將氨基、羧基、羥基等功能基團(tuán)修飾到CDs上[10],故上述制備方式常常被用于納米生物傳感器的制作。

超聲波是一種波長(zhǎng)極短的機(jī)械波,具有較強(qiáng)的能量。利用超聲波的機(jī)械破碎性質(zhì)制作CDs僅需要氧化劑和超聲波設(shè)備,故被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的制備方法。PARK 等[16]將食物垃圾的乙醇溶液用40 k Hz超聲波處理45 min后離心,得到了綠色熒光的CDs。但當(dāng)在有氧環(huán)境下超聲處理CDs時(shí),附著在CDs上的熒光會(huì)因強(qiáng)烈的氧化作用而猝滅,導(dǎo)致量子產(chǎn)率的急劇下降,仍需要進(jìn)一步使用水熱法以形成新的熒光基團(tuán)[17]。

1.1.2 自下而上的制備方法

熱分解法是目前最有可能實(shí)現(xiàn)大批量CDs工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法之一。它通過(guò)加熱裂解含碳前體,在短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生CDs。工業(yè)化生產(chǎn)中可以通過(guò)控制反應(yīng)的酸度、溫度、回流時(shí)間、碳化度等來(lái)控制CDs產(chǎn)物的熒光特性[18-20]。MA 等[21]建立了一種以乙二胺四乙酸(EDTA)為前體通過(guò)熱分解法制備石墨烯量子點(diǎn)的方法,該方法操作簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑、前體耐受性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、成本低和可擴(kuò)展生產(chǎn)。此外,以檸檬酸為前體的CDs也可以使用熱分解法進(jìn)行制備[22]。

水熱法是指通過(guò)水熱碳化(HTC)技術(shù)制備CDs,是目前最常用的CDs制備方法。該方法是將有機(jī)前體密閉于高溫高壓容器中進(jìn)行一定時(shí)間的碳化。水熱法制備的CDs在紫外光的照射下能夠顯示出多種穩(wěn)定的發(fā)射熒光[1],熒光發(fā)射的波長(zhǎng)和所使用的有機(jī)前體具有一定的關(guān)系[23]。一步水熱法最早建立于2013年,GUO 等[24]利用檸檬酸鈉和碳酸氫銨一步制備了熒光碳量子點(diǎn),將CDs制備的量子產(chǎn)率提高至68%。

微波可為前體分子中化學(xué)鍵的斷裂提供能量,常常與熱分解法或水熱法聯(lián)用。ROMERO 等[25]將微波法和水熱法結(jié)合制備CDs,YU 等[26]將微波法與熱分解法結(jié)合制備酸度敏感的綠色CDs。

模板法制備CDs一般包含兩步:①在模板中煅燒制備所需的CDs;②蝕刻去除支撐物[1]。LIU等[27]以二氧化硅微球作為模板載體,以甲階酚醛樹脂為前體,2 mol·L－1氫氧化鈉溶液蝕刻48 h除去二氧化硅微球,制備了多色CDs,量子產(chǎn)率為14.7%。

1.2 CDs探針的功能化設(shè)計(jì)策略

1.2.1 核酸包被的CDs探針

使用核酸包被納米材料是近年來(lái)PoCT 技術(shù)的新趨勢(shì),一些研究表明核酸能夠通過(guò)氫鍵、π-π堆疊或疏水作用與CDs相互結(jié)合[28-30],從而被連接在一起。GARCíA-MENDIOLA 等[31]基于CDs開發(fā)了一種一次性電化學(xué)DNA 生物傳感器,用于識(shí)別聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)樣品中的基因突變,該CDs通過(guò)乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)熱分解法制備,能夠有效固定DNA 并保持其雜交能力。MILOSAVLJEVIC等[32]以檸檬酸作為碳源,以聚乙二醇(PEG)作為封端劑,增強(qiáng)了CDs的光學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性,將DNA 與CDs溶液混合制備得到了CDs＠DNA 復(fù)合物,并對(duì)其進(jìn)行了電化學(xué)、光學(xué)以及電泳性能的表征。

雖然單鏈DNA 能夠通過(guò)簡(jiǎn)單混合的方法固定到富含羧基的CDs表面上,但這種固定方法不是牢固而不可逆的。WEI等[33]用單鏈DNA 包被CDs,利用單鏈DNA 與丙烯酰胺(AM)的高親和力使其與CDs產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng),當(dāng)樣本中存在AM 時(shí)單鏈DNA優(yōu)先與AM 結(jié)合,將其從CDs中爭(zhēng)奪下來(lái),從而暴露CDs產(chǎn)生熒光。這種競(jìng)爭(zhēng)性“關(guān)-開”的發(fā)光機(jī)制,或許可以通過(guò)對(duì)比檢測(cè)對(duì)象與核酸探針、核酸探針與CDs之間作用力大小進(jìn)行預(yù)測(cè),從而用于更多的檢測(cè)方法中。

1.2.2 雜原子摻雜的CDs探針

雜原子摻雜能夠通過(guò)改變CDs固有的電子特性、增加表面活性位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)和改善CDs的熒光特性[34],這在細(xì)胞成像和微生物檢測(cè)等微量分析中非常重要。為了獲得更好的生物成像效果以及更高的熒光強(qiáng)度,氮和硫原子常常被摻雜進(jìn)CDs中。LI等[35]以尿素和半胱氨酸為碳源、氮源及硫源,采用水熱法制備氮硫摻雜的CDs,并測(cè)定菇類食品中維生素B2,檢出限達(dá)到5.0×10－8mol·L－1。WEI等[36]以水熱法制備了氮硫摻雜的CDs,其光致發(fā)光性能在不同的酸度、高含量氯化鈉和不同金屬離子的環(huán)境中均穩(wěn)定保持,能被用于MCF-7和K562細(xì)胞質(zhì)中的多色成像。ROMERO 等[37]采用化學(xué)氧化法制備氮硫摻雜的CDs,并用于廢水中高碘酸根的檢測(cè),其量子產(chǎn)率達(dá)到22%,這甚至超過(guò)了一些水熱制備的成像用CDs[38-39]。LIU 等[40]利用氮硫摻雜的CDs完成了對(duì)酸度和溫度(10～70 ℃)的傳感,并建立了一種定位于細(xì)胞核的RNA 選擇性成像技術(shù),進(jìn)一步對(duì)氮硫摻雜CDs與DNA 或RNA的親和力進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)氮硫摻雜可以使CDs特異性結(jié)合RNA 而不是DNA,這一發(fā)現(xiàn)能被用于基于CDs的RNA 特異性探針的設(shè)計(jì)。

其他雜原子的摻雜也能夠改變CDs的光學(xué)特性和檢測(cè)對(duì)象特異性,例如磷氯摻雜的CDs能夠特異性檢測(cè)Fe3＋[41],氮磷摻雜的CDs能夠在血清和尿液中檢測(cè)Cd2＋[42]。環(huán)境因素也能改變CDs的檢測(cè)性能,由于水熱法合成的CDs表面能夠通過(guò)共價(jià)鍵連接豐富的羧基、酚羥基等酸性基團(tuán),它們可逆的質(zhì)子化和去質(zhì)子化造成了電子能級(jí)的變化,并直接導(dǎo)致了CDs熒光性質(zhì)的改變[43]。氮氟摻雜的CDs在pH 13時(shí)能夠檢測(cè)硅,而在pH 8時(shí)則能夠檢測(cè)汞[44]。利用酸度對(duì)雜原子摻雜CDs的影響,路雯婧等[45]合成了pKa為5.32的鐵摻雜CDs,能夠通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化線性地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH 在4.4～6.2內(nèi)的變化。溫度變化也能夠通過(guò)熱力學(xué)的粒子效應(yīng)影響CDs的熒光性質(zhì),當(dāng)溫度上升時(shí)粒子振動(dòng)增加,碰撞頻率增加,當(dāng)CDs相互靠近時(shí)其熒光會(huì)被淬滅,體系中的熒光強(qiáng)度也會(huì)相應(yīng)下降。陳文靜等[46]合成的氮硫摻雜的CDs利用這一原理,在20～55 ℃內(nèi)通過(guò)測(cè)量415 nm 處的熒光強(qiáng)度來(lái)線性反映溫度的變化。

諸多文獻(xiàn)也提示其他雜原子摻雜能夠調(diào)節(jié)和改善CDs熒光特性,如磷[47]、氮[47-49]、硫[49]、硼[50]等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDs的光學(xué)性質(zhì)和檢測(cè)對(duì)象特異性能夠通過(guò)表面雜原子修飾的方法進(jìn)行優(yōu)化,不同的原子摻雜可以給CDs增添不同的檢測(cè)對(duì)象和功能,酸度等環(huán)境因素也能夠影響CDs和檢測(cè)對(duì)象之間的互相作用。

1.3 CDs的表征技術(shù)

與其他的納米粒子表征方法相同,CDs的粒子形貌一般通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)、透射電子顯微鏡(TEM)等手段進(jìn)行表征。

AFM 是一種利用探針尖端與樣品表面相互作用而成像的顯微方法,可提供CDs的二維和三維圖像。TEM 利用電子束與CD 樣品相互作用產(chǎn)生的散射來(lái)生成明暗圖像,以觀察CDs的粒徑。DONG等[51]制備了抗菌量子點(diǎn),并用AFM 和TEM 的方法進(jìn)行了表征,結(jié)果顯示CDs的高度約4 nm,粒徑約5 nm,在二維圖像中呈圓形。

部分具有熒光性質(zhì)的CDs常常需要對(duì)其光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)是一種常見的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析方法,制備后的CDs可通過(guò)這種方法進(jìn)行表征,獲取其表面的化學(xué)基團(tuán)信息,從而決定之后的修飾方式。MEHTA 等[38]通過(guò)FTIR 分析制備的CDs得知其表面有豐富的O－H、C－H、C＝O、C＝C、C－N 和C－O 基團(tuán)。X 射線晶體衍射結(jié)果表明其中含有湍層碳和石墨碳。

紫外-可見吸收光譜法以及熒光光譜法也常被用作CDs的表征手段。根據(jù)MEHTA 等的表征結(jié)果,制備的CDs的紫外可見光吸收波長(zhǎng)為250 nm和300 nm,熒光激發(fā)波長(zhǎng)為368 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為475 nm。

對(duì)于多色量子點(diǎn),也可以通過(guò)紫外吸收峰的位置進(jìn)行區(qū)別。JIANG 等[23]制備了紅綠藍(lán)3色的光致發(fā)光CDs,并采用紫外-可見吸收光譜法對(duì)制備的熒光量子點(diǎn)進(jìn)行表征。3種CDs的紫外-可見吸收光譜顯示其吸收峰位置類似,表明其具有類似的性質(zhì),并在不同波長(zhǎng)處具有各自的熒光發(fā)射。

2 基于CDs的PoCT方法的應(yīng)用

2.1 食品安全

食品的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)都有污染的可能,原料質(zhì)量不佳、農(nóng)藥殘留、違規(guī)添加、摻假等現(xiàn)象是較為常見的食品安全問(wèn)題,嚴(yán)重影響消費(fèi)者的健康[52],因此快速的PoCT 方法亟待建立。

有機(jī)磷類化合物如甲基對(duì)硫磷、草甘膦、敵敵畏等是常用的一大類農(nóng)藥,微量的有機(jī)磷農(nóng)藥就能導(dǎo)致嚴(yán)重的腸胃道反應(yīng)、臟器衰竭甚至死亡[53],目前還沒有針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥有效的解毒劑,其在食物中的殘留越來(lái)越得到人們的關(guān)注。LI等[54]以巰基乙酸單乙醇胺為前體制備氮硫共摻雜的CDs,用于檢測(cè)蘋果表面的甲萘威。WANG 等[55]采用微波輔助熱解工藝由羊毛制備CDs,量子產(chǎn)率達(dá)到16.3%,并成功在谷物樣品中完成草甘膦的檢測(cè)。敵敵畏是一種廣為人知的農(nóng)用殺蟲劑,曾被大量用于農(nóng)業(yè)而導(dǎo)致嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留。敵敵畏是乙酰膽堿酯酶(AChE)的不可逆抑制劑[56],會(huì)導(dǎo)致突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿的含量升高,產(chǎn)生尼古丁和毒蕈堿癥狀,常伴隨有中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒[57],死亡率極高。HOU等[58]使用季銨化CDs構(gòu)建了一種量子產(chǎn)率高達(dá)34.2%的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)敵敵畏傳感器,檢測(cè)線性范圍為5.0×10－11～1.0×10－7mol·L－1,并在卷心菜和果汁中進(jìn)行了驗(yàn)證[59]。

原料檢測(cè)是保證食品安全的重要環(huán)節(jié),如水的檢測(cè)等。ZHOU 等[60]將CDs作為納米探針檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)如湖水中的Hg2＋和生物硫醇。韓愛霞等[61]利用廢棄的豌豆莢作為碳源,合成了能被Hg2＋高效淬滅的氮摻雜CDs,并得到了線性的熒光滴定工作曲線。硅烷修飾的CDs具有與氮摻雜相似的性質(zhì),一些硅烷修飾的CDs也能夠檢測(cè)Hg2＋、Fe3＋和Cr(Ⅵ)[62-65]。這些研究提示了相似原子修飾的CDs可能具有相似的檢測(cè)功能。鄰苯二甲酸二丁酯是一種塑化劑,常被用于生產(chǎn)聚氯乙烯材質(zhì)的各種食品藥品包裝,它不易與塑料共價(jià)結(jié)合而進(jìn)入食品中造成污染[66]。鄰苯二甲酸二丁酯是潛在的致癌物,也具有生殖毒性,孕婦暴露于鄰苯二甲酸二丁酯環(huán)境中易導(dǎo)致新生兒體重降低[67]。徐志祥等[68]用水熱法以抗壞血酸前體制備CDs,隨后與胺化的核酸適配體連接,制備了雙發(fā)射CDs標(biāo)記核酸適配體,通過(guò)熒光比值法建立了食品中鄰苯二甲酸二丁酯的超靈敏快速檢測(cè)方法,并以此申請(qǐng)了專利。LIU 等[69]將CDs與Mn O2納米片結(jié)合作為檢測(cè)抗壞血酸的熒光探針,檢出限達(dá)42 nmol·L－1。付海燕等[70]采用水熱法制備碳量子點(diǎn),利用其熒光性質(zhì)檢測(cè)食物中的摻假淀粉,并在咖啡中進(jìn)行了驗(yàn)證。

目前CDs常用于金屬離子的檢測(cè)[71],在食品安全方向的應(yīng)用較少,多集中于化學(xué)檢測(cè)而缺少生物檢測(cè)。檢測(cè)對(duì)象也偏重于水源、果蔬、包裝等組成成分單一或無(wú)需復(fù)雜加工的食品或食品包裝。對(duì)于加工后食品樣本的檢測(cè)研究較少,這可能是由于復(fù)雜的食品加工方法使得樣本的組成增加,一種CDs可能會(huì)結(jié)合多種靶標(biāo),導(dǎo)致嚴(yán)重的假陽(yáng)性結(jié)果,從而使檢測(cè)特異性降低,無(wú)法滿足食品安全檢測(cè)的需要。因此,CDs的功能化方法及其檢測(cè)對(duì)象的分類歸納、機(jī)制的研究就顯得非常重要,這或許是成功預(yù)測(cè)CDs表面修飾和檢測(cè)對(duì)象之間聯(lián)系的突破口。

2.2 檢疫與臨床檢測(cè)

檢疫是防止疾病傳播、物種入侵的重要手段,隨著海內(nèi)外貿(mào)易的不斷發(fā)展,快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法亟待建立。CDs是一種便于制備、經(jīng)濟(jì)、綠色,具有PoCT 潛力的新型納米材料,常被應(yīng)用于微生物標(biāo)志物的即時(shí)檢測(cè)。CHEN 等[72]利用EDTA 采用水熱法制備了量子產(chǎn)率高達(dá)43.6%的CDs,將鋱以配位鍵的方式結(jié)合到CDs上,對(duì)CDs進(jìn)行功能化,上述用鋱?jiān)庸δ芑腃Ds可以特異性結(jié)合炭疽生物標(biāo)志物2,6-吡啶二羧酸(DPA)。RONG 等[73]以氯化錳和檸檬酸為原料,采用熱解法制備藍(lán)色熒光的錳摻雜CDs(Mn-CDs),將上述CDs滴在圓形濾紙上后干燥,得到的熒光試紙也可以特異性結(jié)合DPA。該試紙?jiān)谧贤鉄粝履苡弥悄苁謾C(jī)軟件拍攝成像定量,檢出限為1μmol·L－1。在研究上述Mn-CDs時(shí)還發(fā)現(xiàn),當(dāng)錳的摻雜量上升時(shí),CDs的量子產(chǎn)率也逐漸增加,當(dāng)錳摻雜達(dá)到25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí),Mn-CDs的量子產(chǎn)率達(dá)到最大(13.5%),相較于摻雜前的8.3%,具有顯著的增強(qiáng)效果。參考CHEN 和RONG 等[72-74]的研究,ZHOU 等[75]用同為鑭系元素的銪替代鋱對(duì)CDs進(jìn)行功能化,也能夠用于檢測(cè)DPA。用上述銪摻雜的CDs設(shè)計(jì)了雙比例光學(xué)探針,建立了DPA 的比色和熒光視覺檢測(cè)方法,檢出限分別為10.6 nmol·L－1和1μmol·L－1。上述研究發(fā)現(xiàn),鑭系元素功能化的CDs都能夠特異性識(shí)別DPA,并且具有近似的檢出限,這再次提示了用相似元素對(duì)CDs進(jìn)行功能化可能能夠使其具有類似的檢測(cè)功能。

流行病病原體也是檢疫重要的檢測(cè)對(duì)象。WANG 等[76]以CDs與核酸適配體結(jié)合定量檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌,檢出限為50 CFU·mL－1。2019年新型冠狀病毒疫情的爆發(fā)對(duì)病毒檢測(cè)提出了更高的要求,各種基于CDs的病毒檢測(cè)方法也逐漸得到重視[77],XU 等[78]研發(fā)了一種側(cè)向流免疫層析方法來(lái)檢測(cè)新型冠狀病毒,使用基于CDs的二氧化硅微球,經(jīng)碳化二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)將新型冠狀病毒核衣殼蛋白抗體與CDs二氧化硅微球偶聯(lián),作為側(cè)向流免疫層析的上樣預(yù)混液。上述側(cè)向流免疫層析試紙條在紫外燈下檢測(cè)靈敏度為100 ng·L－1,操作便捷,也可以使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析,熒光顯微鏡下綠光激發(fā)檢測(cè)靈敏度為10 ng·L－1,靈敏度較紫外燈下的提升10倍。以抗原和單克隆抗體為基礎(chǔ)衍生出的免疫分析技術(shù)現(xiàn)已成為PoCT 的主流,在此次新型冠狀病毒疫情中發(fā)揮了重要作用。選用富含氨基的碳源合成的氨基化CDs能夠結(jié)合酰胺化的蛋白,張春林等[79]利用氨基葡萄糖合成氨基化CDs,采用化學(xué)偶聯(lián)法將其與大腸桿菌抗體連接,相同的方法也有望用于CDs與抗原的連接,以提供更快速、易于獲得的抗原試劑盒。

作為PoCT 的一種應(yīng)用,床邊檢測(cè)逐漸成為臨床檢測(cè)方向的新趨勢(shì)。CDs的快捷性、簡(jiǎn)便性使其在血液檢查中非常受歡迎,同時(shí)其較小的分子尺寸、良好的生物相容性、低毒性和強(qiáng)熒光性質(zhì)使其成為一種良好的生物成像材料。

鎘被廣泛用于各種工業(yè)制品的生產(chǎn)中,它不是人體的必需元素,從被污染的空氣、水和食物中攝入過(guò)量的鎘會(huì)引起鎘中毒。鎘中毒的常見臨床表現(xiàn)為貧血、腎臟損傷,骨質(zhì)中的鈣被鎘置換引起骨軟化和骨質(zhì)疏松,嚴(yán)重時(shí)能夠?qū)е鹿钦酆屯赐床?itai-itai disease,是鎘中毒的一種癥狀)[80-81]。此外,鎘中毒還有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[82]。為了避免從水源攝取過(guò)量的鎘,NIU 等[83]設(shè)計(jì)了由CDs 與金納米團(tuán)簇(Au NCs)組成的納米雜化物,以測(cè)定湖水中的鎘,通過(guò)組氨酸和丙氨酸水熱法制備發(fā)藍(lán)色光的CDs,用11-巰基十一烷酸(MUA)封端的發(fā)紅色光的Au NCs對(duì)其進(jìn)行功能化,從而特異性識(shí)別鎘離子,此外該CDs還能夠檢測(cè)人血清中的抗壞血酸。裴元生等[84]用CDs修飾玻碳電極后鍍鉍膜,用于檢測(cè)地下水中鎘和鉛,質(zhì)量濃度為0.25 mg·L－1時(shí)能報(bào)告非常高的峰電流。劉意等[85]利用氮硼共摻雜的CDs檢測(cè)溶液中的鎘,利用熒光增強(qiáng)效應(yīng)準(zhǔn)確建立了光強(qiáng)與鎘含量的關(guān)系,為鎘定量檢測(cè)提供了新思路。HUANG 等[86]將氮鈷共摻雜的熒光磁性CDs作為人體血清中膽固醇和尿酸的比率熒光探針,可作為快速的臨床診斷方法。CHELLASAMY 等[87]將CDs熒光檢測(cè)與智能手機(jī)結(jié)合,通過(guò)智能手機(jī)上比色傳感器陣列閱讀系統(tǒng)對(duì)老年人血漿中的多巴胺進(jìn)行檢測(cè)。

CDs具有良好的生物相容性和低毒性。XU等[88]通過(guò)水熱法制備碳量子點(diǎn)以穩(wěn)定釓納米探針,可作為核磁共振成像(NMRI)的造影劑,也能通過(guò)熒光成像。ZHANG 等[89]使用干酵母微波熱解得到綠色的發(fā)光CDs,并進(jìn)行葉酸功能化來(lái)對(duì)葉酸受體陽(yáng)性的癌細(xì)胞進(jìn)行成像。KALYTCHUK 等[90]使用氮硫摻雜的CDs光致發(fā)光的壽命推算被測(cè)細(xì)胞的溫度,為癌癥熱療提供了準(zhǔn)確的組織溫度測(cè)量方法。新成像技術(shù)是診斷醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)目標(biāo),CDs可以通過(guò)口服或注射的方法進(jìn)入體內(nèi)并被運(yùn)送到病灶處進(jìn)行顯影。NIU 等[91]利用蛋白質(zhì)-CDs在大腦中有著顯著的成像效果來(lái)檢測(cè)早期的血腦屏障損傷,并估計(jì)溶栓后癥狀性顱內(nèi)出血的情況。DAS等[92]使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X)作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑,以吡咯和苯胺為前體,制備了氮摻雜的CDs,它能夠在實(shí)現(xiàn)熒光成像的同時(shí)具有良好的光熱效應(yīng),在980 nm 近紅外光下誘導(dǎo)人口腔癌細(xì)胞發(fā)生熱消融效應(yīng),既能夠完成檢測(cè)又能夠準(zhǔn)確可控地殺滅癌細(xì)胞,是一種新穎的癌癥熱療方法。此外,將CDs添加入組織再生支架中,在維持支架機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí),還能增加其抑菌和監(jiān)測(cè)能力,一些添加了CDs的支架材料還具有誘導(dǎo)組織增殖和定向分化的作用[93]。

3 總結(jié)與展望

作為一種新型的納米材料,CDs便于制備、生物相容性好、環(huán)保低毒,同時(shí)CDs的熒光、光熱效應(yīng)顯著,且易于與其他固相載體連接,因而被廣泛應(yīng)用于各類PoCT 方法中。CDs能夠通過(guò)多種途徑制備,其中水熱法制備的CDs色彩多樣、量子產(chǎn)率高、表面易于功能化。雜原子摻雜的CDs具有更好的量子產(chǎn)率,摻雜了同一類元素的CDs有較為近似的性質(zhì),但具體機(jī)制仍未可知,有待進(jìn)一步研究。此外,CDs作為造影劑,相對(duì)分子質(zhì)量較小,能夠穿過(guò)血腦屏障完成腦中成像,有利于腦科疾病的預(yù)防和診斷。目前CDs的成像多應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞或裸鼠注射試驗(yàn),并得到了較好的結(jié)果。

CDs的合成成本低、應(yīng)用面廣,但目前主要的合成方法停留在實(shí)驗(yàn)室階段,大批量的工業(yè)合成仍然沒有實(shí)現(xiàn)。已知的合成方法中熱分解法和水熱法是最便于合成、量子產(chǎn)率最高的方法。通過(guò)擴(kuò)大合成規(guī)模,優(yōu)化和篩選各個(gè)步驟在放大試驗(yàn)中的條件改變,參考其他納米材料的生產(chǎn)線進(jìn)行調(diào)整和適應(yīng),或許是解決CDs工業(yè)化生產(chǎn)的好方法。CDs通常具有較低的生物毒性,但進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CDs仍有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這主要是因?yàn)楸患?xì)胞內(nèi)化的CDs可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生光致?lián)p傷或催化活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激[94],如何鈍化或如何功能化CDs以有效降低其生物毒性值得深入研究。前期不少研究也發(fā)現(xiàn)雜原子摻雜的CDs具有多種多樣的性質(zhì),但CDs檢測(cè)對(duì)象的篩選往往是通過(guò)偶然發(fā)現(xiàn)或比對(duì)淬滅效果篩選得到的,效率低、普適性差。因此,CDs特異性檢測(cè)的具體機(jī)制亟待研究,通過(guò)比較相似雜原子摻雜CDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行功能歸類,可能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)功能的預(yù)測(cè)?，F(xiàn)今高通量也逐漸成為PoCT 方法追求的熱點(diǎn),多色CDs的合成和應(yīng)用也為其高通量檢測(cè)方法的誕生奠定了良好的基礎(chǔ),適用于普通打印機(jī)的CDs墨水也擴(kuò)展了CDs的應(yīng)用方式[95]。隨著對(duì)CDs制備方法和功能機(jī)理的進(jìn)一步研究,CDs的應(yīng)用將越來(lái)越多樣化,更多基于CDs的PoCT 檢測(cè)方法值得期待。