UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS法測(cè)定山東產(chǎn)區(qū)丹參中丹酚酸類成分

東莎莎，程素盼，馬天宇，劉偉，張渝潔，王曉，劉代成，趙恒強(qiáng)*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250014； 3.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005; 4.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，丹參中丹酚酸類成分有明顯的抑制血小板聚集、抗凝血及降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，能縮小心肌梗死的范圍，減輕病情，具有較大的臨床藥用價(jià)值，廣泛用于臨床各種心血管疾病的治療[4-5]。2015版《中國藥典》將丹酚酸類的丹酚酸B作為質(zhì)控指標(biāo)[1]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，單一的指標(biāo)成分不能全面反映中藥的質(zhì)量。因此，丹參中丹酚酸類、多成分的同時(shí)分析測(cè)定是提升丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的必然要求。

目前，丹參中丹酚酸類成分主要采用超聲和水浴回流法提取[1,6-7]，用反相色譜法進(jìn)行分析。超聲提取法在提取過程中由于其熱效應(yīng)會(huì)造成提取溶劑溫度升高，水浴回流提取本身采用溶劑加熱、蒸發(fā)、冷凝回流方式提取，而丹參酚酸類成分本身是熱不穩(wěn)定成分，兩種提取方式不可避免會(huì)造成目標(biāo)物一定程度的分解，影響最終測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性。另外，丹參中丹酚酸類成分在反相色譜柱上保留較差，為提高保留效果，一般采用高比例水相進(jìn)行洗脫，然而高比例水相會(huì)影響色譜柱使用壽命，同時(shí)與質(zhì)譜的兼容性較差。因此，發(fā)展探究丹參中丹酚酸類、多成分的準(zhǔn)確、高效提取和對(duì)色譜、質(zhì)譜兼容性好的分析方法具有重要意義。

超高壓(ultrahigh pressure extraction, UPE)提取技術(shù)是近年來新發(fā)展的一種高效提取技術(shù)，利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液，保壓一段時(shí)間后卸壓，因其內(nèi)外壓差驟變使細(xì)胞破裂，有效成分釋放出來，從而達(dá)到提取的目的。該方法與超聲波輔助提取法和水浴回流提取法相比有提取率高、提取時(shí)間短、能耗低、純度高[8-10]等優(yōu)點(diǎn)，并且避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低。目前，該技術(shù)在天然化學(xué)成分提取中的應(yīng)用越來越廣泛，已成功提取了黃酮、皂苷、生物堿、茶多酚等多種中藥化學(xué)成分[11]。親水色譜(HILIC)是一種新型色譜分離技術(shù)，其采用強(qiáng)極性材料作為固定相，對(duì)極性和水溶性成分保留較好；以高比例的乙腈作為有機(jī)相，與質(zhì)譜兼容性較好；與電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-TOF/MS)聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)對(duì)極性成分的良好分離和鑒別。目前，該技術(shù)在天然產(chǎn)物極性成分分析中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[12-16]。

本研究建立了UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS提取和分析測(cè)定丹參中丹酚酸類成分的方法，并用于山東產(chǎn)區(qū)丹參藥材中丹酚酸類成分的測(cè)定，研究結(jié)果將為丹參中丹酚酸類多成分的高效提取和分析測(cè)定提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有二極管陣列(DAD)檢測(cè)器，四元泵，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器等；Agilent 6520 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HPP·L3-600型超高壓生物提取設(shè)備(天津市華泰森淼有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；THZ-8恒溫水浴鍋(中國浙江嘉興電熱儀器廠)。

XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm，美國Waters)；Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,德國Merck) ；XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm，美國Waters)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)；甲酸、乙酸銨、甲酸銨(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為分析純，水為自制Milli-Q超純水。

1.2 樣品的收集與處理

本研究所采用的丹參樣品均采自濟(jì)南各大藥店以及不同種植基地，采集時(shí)間為2011年至2012年，采集12個(gè)不同批次的樣品，經(jīng)山東省分析測(cè)試中心王曉研究員鑒定為正品丹參SalviamiltiorrhizaeBge.，所采集到的樣品詳細(xì)信息見表1。丹參樣品置于烘箱中55 ℃鼓風(fēng)干燥4 h。干燥后粉碎，過40目篩子，混合均勻，制備成丹參干粉樣品，密閉、避光、干燥、常溫貯藏。

表1 丹參藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 超高壓提取法

a 提取溶劑 b 料液比 c 提取時(shí)間

2.1.2 超聲波輔助提取法

2.1.3 水浴回流提取法

不同提取方式下的色譜圖見圖2。

圖2 不同提取方式下的色譜圖Fig.2 Chromatograms of samples prepared using different extraction methods

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對(duì)照品各1.0 mg，置于1 mL量瓶中，用去離子水定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，保存?zhèn)溆谩＞芪「鲗?duì)照品儲(chǔ)備液適量于1 mL容量瓶中，加去離子水定容至刻度，配成含丹酚酸B 50 μg/mL，含其余標(biāo)準(zhǔn)品40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合對(duì)照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相A：0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨、30%乙腈、10%正丁醇的水溶液，流動(dòng)相B：乙腈(含0.8%甲酸)，流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL，洗脫程序?yàn)門：0-5-12-17-23-27-35-40-43-50-55-57-60-62 min，B%：94%-94%-92%-90%-89%-88%-87%-86%- 86%-85%-60%-50%-45%-20%。優(yōu)化后的色譜圖見圖3。

圖3 丹參HILIC-DAD(280 nm)色譜圖Fig.3 HILIC-DAD (280 nm) chromatogram of Danshen

2.4 質(zhì)譜條件

ESI-MS工作條件如下：負(fù)離子電離模式，霧化氣壓力45 psi，干燥氣(N2)流速10.0 L/min，干燥氣體溫度340 ℃，毛細(xì)管電壓4300 V，裂解電壓100 V，錐孔電壓60 V，全掃描(Scan)質(zhì)荷比(m/z)為50～1000。樣品的總離子流圖見圖4，質(zhì)譜鑒別結(jié)果見表2。

圖4 丹參HILIC-ESI-TOF/MS 總離子流Fig.4 TIC chromatogram of HILIC-ESI-TOF/MS of Danshen

表2 丹參提取物中7個(gè)化合物的HILIC-ESI-TOF/MS測(cè)定結(jié)果

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

按2.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液中各化合物的峰面積，以各化合物濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至低濃度進(jìn)樣，以3倍信噪比計(jì)算各丹酚酸類成分的檢測(cè)限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表3。

表3 7種酚酸HILIC分析回歸方程、線性范圍等結(jié)果

2.5.2 精密度

按2.3節(jié)色譜條件，對(duì)同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定，分別測(cè)得7個(gè)色譜峰的峰面積和保留時(shí)間，分別計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%～3.79%和0.31%～2.25%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性

精密稱取同一丹參樣品6份，按2.1供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照2.3節(jié)色譜工作條件進(jìn)樣分析，測(cè)得7個(gè)色譜峰的峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.59%～4.43% 和1.31%～2.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性

將供試品溶液按照2.3節(jié)色譜工作條件，分別在0、1、3、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，7個(gè)色譜峰峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.48%～3.25%和0.72%～2.48%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.5 加標(biāo)回收率

精密稱取已知各目標(biāo)化合物含量的丹參樣品0.50 g，分別準(zhǔn)確加入丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對(duì)照品適量，按照供試品溶液制備方法處理6 份，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各目標(biāo)化合物峰面積，計(jì)算平均加樣回收率(n= 6)分別為92.1%、95.7%、98.7%、102.7%、99.2%、95.8%、94.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.43%、2.79%、4.17%、3.36%、3.18%、2.53%及3.57%。

2.6 樣品測(cè)定

采用2.1節(jié)供試品溶液制備方法制備樣品溶液，采用2.3節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣分析，獲得12批丹參樣品中7種丹酚酸類化合物色譜峰面積，將測(cè)得結(jié)果帶入表3的線性回歸方程，計(jì)算丹參樣品中各丹酚酸類化合物的含量(表4)。

表4 丹參中7種丹酚酸類化合物含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

續(xù)表4

從表4 可以看出，12批山東產(chǎn)區(qū)丹參樣品中7種丹酚酸類成分含量以丹酚酸B含量最高，其平均值達(dá)到(38.725±5.464)mg/g；原兒茶醛的含量最低，其平均值達(dá)到(0.124±0.011)mg/g；7種丹酚酸類成分總含量為(45.714±5.537)mg/g。7種丹酚酸類成分含量由大到小依次為丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸、丹酚酸A、熊果酸、原兒茶醛。

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

本研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)超高壓提取條件進(jìn)行了優(yōu)化?？疾炝瞬煌崛∪軇?水、20%甲醇、40%甲醇)對(duì)丹參水提物的提取效果(圖1a)，結(jié)果表明，用20%甲醇作提取溶劑時(shí)，丹參水提取物中4個(gè)代表性色譜峰(峰1、2、3、7)的相對(duì)峰面積(以水提物中4個(gè)代表色譜峰的相對(duì)峰面積作為1)整體較高，且色譜峰較多、各峰分離度好、基線平穩(wěn)，因此選擇20%甲醇作為丹參中丹酚酸類成分的提取溶劑。

在優(yōu)化的超高壓提取條件下，進(jìn)一步對(duì)超高壓提取法、超聲波輔助提取法和水浴回流提取法進(jìn)行了比較，如圖2所示。結(jié)果表明，采用超高壓提取法，丹參中丹酚酸類成分提取率明顯優(yōu)于超聲波輔助提取法和水浴回流提取法。

3.2 色譜條件優(yōu)化

不同的親水柱材料對(duì)親水性化合物分離效果存在明顯差別。本研究對(duì)1.1節(jié)中所列的3 根不同類型的色譜柱(XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm，美國Waters)、Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，德國Merck)、XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美國Waters)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，使用Waters XBridge Amide色譜柱獲得的丹參甲醇水提取物各色譜峰分離度高、分布均勻、峰對(duì)稱性較好。因此，選擇Waters XBridge Amide柱用于丹參甲醇水提取物的分析。

水和乙腈常被選作親水色譜的流動(dòng)相，丹參中丹酚酸類成分復(fù)雜、數(shù)量較多，本研究采用乙腈-水作為流動(dòng)相、采用梯度洗脫法用于其分離研究。由于酚酸類成分含有羧基，容易與色譜柱填料發(fā)生作用造成拖尾現(xiàn)象，加入一定量的有機(jī)弱酸會(huì)明顯抑制羧酸的電離，避免拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。另外，流動(dòng)相中加入一定量的揮發(fā)性鹽，有助于改善色譜峰峰型，同時(shí)避免或減少對(duì)質(zhì)譜離子化的影響。考察了水相和有機(jī)相中分別加入不同含量甲酸揮發(fā)性鹽的影響，結(jié)果表明，當(dāng)選擇H2O(0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨)+乙腈(0.8%甲酸)作流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離良好，峰型尖銳。

由于乙腈-水體系對(duì)親水色譜柱上各丹酚酸類化合物洗脫能力較強(qiáng)，造成分離效果差?？疾炝怂嘀刑砑硬煌壤译?、正丁醇的分離效果，結(jié)果表明，采用0.8%甲酸+20 mmol/L甲酸銨+30%乙腈+10%正丁醇作為流動(dòng)相A時(shí)，丹參水提物中各化合物具有較好的保留和分離效果。