冷藏鮮切獼猴桃片微生物污染的近紅外檢測

閆思雨,寇婕妤,張 茜,張 敏,周媛媛,王若晨,孫宏民,王虎玄

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

獼猴桃(奇異果)營養(yǎng)豐富，口感酸甜，具有降火通便、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等保健功效，是消費(fèi)者喜愛的滋補(bǔ)水果之一[1].陜西省獼猴桃種植面積和產(chǎn)量居全國第一，以秦嶺北麓(周至縣、眉縣以及武功縣為主)為主產(chǎn)區(qū)，獼猴桃資源極其豐富[2].隨著人們對高質(zhì)量生活的追求和對服務(wù)水平要求的提高，鮮切果片市場不斷壯大，“水果撈”、“水果沙拉”、“鮮果茶”等逐漸流行，發(fā)展勢頭迅猛.鮮切果片是以鮮果為原材料，經(jīng)過清洗、去皮、切分、修整、包裝、冷藏等加工過程制成的可供即食的水果加工品[3].由于獼猴桃的營養(yǎng)、保健價(jià)值，鮮切獼猴桃片備受消費(fèi)者青睞.

然而，由于去皮、切分等工序造成果片裸露和汁液外滲，汁液中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為微生物繁殖創(chuàng)造了有利條件，同時切片工序也增加了微生物對獼猴桃片的污染機(jī)率，微生物污染難以避免.獼猴桃片冷藏過程中，果實(shí)內(nèi)部組織損傷不斷加重，造成切片表面逐漸變成深褐色，汁液大量流失，微生物尤其是嗜冷菌大量繁殖引起腐爛變質(zhì).此外，獼猴桃是典型的呼吸躍變型水果[4]，呼吸活性隨著成熟度的升高不斷增強(qiáng)[5]，導(dǎo)致冷藏過程中鮮切獼猴桃片腐敗變質(zhì)速度不斷加快.這些不良因素對獼猴桃片質(zhì)量安全和國內(nèi)外貿(mào)易造成負(fù)面影響，也對獼猴桃深加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展形成阻礙[6].因此，對鮮切獼猴桃片冷藏過程中微生物污染水平進(jìn)行快速檢測具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

果蔬微生物污染傳統(tǒng)檢測方法主要基于微生物分離純化后的形態(tài)觀察、生理生化和分子鑒定，費(fèi)時費(fèi)力，所需樣品量較大且對樣品具有破壞性，同時由于操作因素和環(huán)境差異的影響導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差較大[7].高效液相色譜、氣相色譜質(zhì)聯(lián)用和酶聯(lián)免疫法等微生物污染檢測方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[8-10].但從檢測時間、檢測成本以及儀器操作要求方面考慮，上述方法并不適用于大量樣品的快速檢測.光譜技術(shù)具有簡便快速、無破壞性、綠色無污染、智能操作、靈敏度高、誤差較小等優(yōu)點(diǎn)[11]，近年來被證明是一種有效的微生物污染識別方法，在果蔬品質(zhì)快速檢測方面發(fā)展迅速[12].近紅外光譜可對果片中含氫基團(tuán)產(chǎn)生特征吸收，吸收光譜含有與果片微生物污染相關(guān)的內(nèi)在信息[13].因此，可通過近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立冷藏條件下獼猴桃片微生物污染快速檢測模型，實(shí)現(xiàn)冷藏條件下獼猴桃片品質(zhì)的快速識別.目前針對鮮果及果汁(蘋果[14]、橘子[15]、橙子[16]等)品質(zhì)指標(biāo)的近紅外光譜快速檢測報(bào)道較為常見，但對鮮切獼猴桃片冷藏過程中微生物污染水平快速檢測仍缺乏系統(tǒng)研究.

本研究以陜西省周至縣(獼猴桃產(chǎn)量第一大縣)主栽品種(秦美獼猴桃)為原料，經(jīng)過無菌切片處理后置于4 ℃冷藏，采用稀釋平板法對冷藏過程中獼猴桃片微生物總數(shù)進(jìn)行測定，通過傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)對冷藏過程中獼猴桃片進(jìn)行光譜掃描，并基于偏最小二乘回歸(PLSR)對冷藏過程中獼猴桃片微生物污染水平建立定量檢測模型，以期實(shí)現(xiàn)冷藏條件下鮮切獼猴桃片微生物污染的無損、快速識別，為鮮切獼猴桃片冷藏過程中品質(zhì)變化的實(shí)時動態(tài)監(jiān)控提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)原材料

(1)獼猴桃

陜西省西安市周至縣“秦美”獼猴桃，采摘后帶至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無菌切片處理，置于4 ℃冷藏保存.

(2)主要試劑

氯化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂等(西安科昊生物工程有限責(zé)任公司).

(3)培養(yǎng)基[17]

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂15.00 g，胰蛋白胨5.00 g，葡萄糖1.00 g，酵母浸膏2.50 g，蒸餾水1 000 mL；

營養(yǎng)培養(yǎng)液：氯化鈉5.00 g，牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，蒸餾水1 000 mL；

生理鹽水：氯化鈉8.50 g，蒸餾水1 000 mL.

1.1.2 主要儀器

VECTOR22/N型傅里葉近紅外光譜儀(德國布魯克公司)；JM-B20001型電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；HPX-9162MBE型油電兩用恒溫培養(yǎng)箱(常州潤華電器有限公司)；DXS-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器(杭州俊升科學(xué)器材有限公司);JH-2S型超凈工作臺(西安太康生物科技有限公司)等.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鮮切獼猴桃樣品制備

將新鮮獼猴桃用無菌水洗凈，濾紙瀝干，在超凈工作臺中進(jìn)行去皮.無菌水對去皮果實(shí)沖洗2～3次，濾紙瀝干.在超凈工作臺中用無菌小刀將獼猴桃切成約5 mm薄片(約10 g/片)，裝入無菌自封袋中(24片/包×10包=240片)，置于4 ℃冷藏12天.每3天取2包進(jìn)行近紅外光譜掃描和菌落總數(shù)測定，共進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)(第0、3、6、9、12天取樣).

1.2.2 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)是判斷微生物污染水平的關(guān)鍵依據(jù)，因此，可通過測定鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物總數(shù)的變化來衡量冷藏過程中的微生物污染水平[18].從兩個自封袋中各取10 g樣品分別置于盛有90 mL無菌生理鹽水的燒杯中，搖動燒杯3～5分鐘，制成1∶10樣品均液，上述操作在超凈工作臺中進(jìn)行.通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到微生物總數(shù)檢測的樣品稀釋倍數(shù)分別為102和103(0d)、103和104(3d)、105和106(6d)、106和107(9d)、107和108(12d)，取500μL稀釋液于平皿內(nèi)，搖勻，然后向平皿傾注瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后將所有培養(yǎng)皿置于37 ℃下培養(yǎng)48 h后取出計(jì)數(shù).每個稀釋梯度樣品作3次平行，測定結(jié)果以lg(CFU/g)表示.樣品勻液稀釋方法、測定步驟及計(jì)數(shù)方法均參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB 4789.2-2016)進(jìn)行[19].

1.2.3 近紅外光譜采集

從兩個無菌袋中各取12片獼猴桃直接進(jìn)行近紅外光譜掃描.采集近紅外光譜的儀器參數(shù)如下：固定光纖探頭；波數(shù)范圍12 000～4 000 cm-1；分辨率8 cm-1；掃描次數(shù)64次[20].對每個獼猴桃片樣品前、中、后位置分別進(jìn)行掃描，對不同掃描位置的近紅外光譜進(jìn)行平均后得到每個樣本的代表性近紅外光譜圖[21].

1.2.4 微生物污染水平定量檢測模型建立及優(yōu)化

為了利用近紅外光譜檢測信號對鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平進(jìn)行預(yù)測，采用PLSR方法將菌落總數(shù)對數(shù)值lg(CFU/g)與光譜檢測信號值進(jìn)行擬合.采用光譜分析軟件OPUS 7.0(德國布魯克公司)，從中啟動定量分析2軟件包，按窗口指示添加樣品組分為菌落總數(shù)，并添加近紅外光譜數(shù)據(jù)及稀釋平板法測定的菌落總數(shù)真實(shí)值，并將所有光譜隨機(jī)分為校正集和檢驗(yàn)集[22](校正集∶檢驗(yàn)集=90∶30，各取樣時間點(diǎn)24個重復(fù)樣品中隨機(jī)選取18個樣品作為校正集(18×5)進(jìn)行模型建立，剩余6個樣品作為預(yù)測集(6×5)進(jìn)行模型性能預(yù)測.為了提高所建模型的準(zhǔn)確性與精度，通過留一交互驗(yàn)證法(LOOCV)對校正集進(jìn)行建模).利用軟件包的自動優(yōu)化功能，對原始光譜分別進(jìn)行了減去一條直線、矢量歸一化、求導(dǎo)等11種預(yù)處理后得到優(yōu)化光譜信息.選擇最佳波段范圍、最佳光譜預(yù)處理方式和最佳主成分維數(shù)，并剔除異常光譜數(shù)據(jù)[23]，將這些優(yōu)化值作為檢驗(yàn)參數(shù)并不斷調(diào)試，最后選擇最優(yōu)參數(shù)建立基于近紅外光譜的4 ℃冷藏條件下鮮切獼猴桃片微生物污染水平快速檢測模型.

1.2.5 檢測模型預(yù)測性能評價(jià)

所建PLSR模型預(yù)測性能通過交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV2)、校正均方根誤差(RMSECV)、檢驗(yàn)集檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)(RP2)、檢驗(yàn)均方根誤差(RMSEP)、預(yù)測殘差平方和(PRESS)以及預(yù)測相對分析誤差(RPD)進(jìn)行評價(jià).RCV2越高、RMSECV越小，則近紅外光譜校正模型預(yù)測值越接近于實(shí)測值，模型預(yù)測準(zhǔn)確性越高；RP2越高、RMSEP越小、殘差分布越均勻、PRESS越小，RPD大于3.0時，預(yù)測效果越好[21,22].

各評價(jià)指標(biāo)的計(jì)算公式：

(1)

(2)

(3)

PRESS=∑(Xi-Yi)2

(4)

(5)

式(1)～(5)中:Di為第i個樣品的交叉驗(yàn)證測定值;Yi為第i個樣品的真值；Ym為所有樣品真值的平均值；Xi為第i個樣品的光譜預(yù)測值；SD為檢驗(yàn)集標(biāo)準(zhǔn)差；n為的樣品總數(shù)，R為維數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮切獼猴桃片冷藏過程中菌落總數(shù)測定結(jié)果與分析

圖1為鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中菌落總數(shù)隨冷藏時間延長的變化情況，可看出冷藏12天后獼猴桃片中菌落總數(shù)從2.969±0.016 lg(CFU/g)增加至7.357±0.214 lg(CFU/g).方差分析結(jié)果顯示不同冷藏時間下鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)差異顯著(P<0.05)，表明冷藏時間對鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)有顯著影響.多重比較結(jié)果進(jìn)一步表明各冷藏天數(shù)間鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)差異顯著(P<0.05).鮮切獼猴桃片在4 ℃冷藏12天的過程中菌落總數(shù)隨著冷藏時間持續(xù)呈現(xiàn)快速上升趨勢，這可能是因?yàn)楂J猴桃切片過程中污染的嗜溫菌被低溫抑制，而污染的嗜冷菌如李斯特菌、假單胞菌及耶氏菌等在4 ℃下仍能存活且在較短時間內(nèi)調(diào)整新陳代謝途徑以適應(yīng)低溫環(huán)境，并利用獼猴桃片營養(yǎng)成分快速繁殖，使菌落總數(shù)呈快速上升趨勢[24].0～3天菌落總數(shù)增速較3～9天增速緩慢可能因?yàn)榇藭r間階段處在嗜冷菌的適應(yīng)期.隨著冷藏時間延長，鮮切獼猴桃片中嗜冷菌快速繁殖并分泌蛋白酶、脂肪酶等分解酶，通過酶解作用導(dǎo)致獼猴桃片組織腐爛程度加重，汁液流失增多，逐漸失去光澤[25].有研究指出新鮮果蔬菌落數(shù)應(yīng)不超過5.0 lg(CFU/g)[26]，故在本研究中，4 ℃冷藏6天后鮮切獼猴桃片開始腐敗變質(zhì)，失去食用價(jià)值.

圖1 鮮切獼猴桃片冷藏過程中菌落總數(shù)真值分布

2.2 近紅外原始吸收圖譜分析

圖2為4 ℃冷藏條件下鮮切獼猴桃片樣品全波數(shù)范圍(4 000～12 000 cm-1)內(nèi)的近紅外原始吸收光譜圖.可以看出，鮮切獼猴桃片在各檢測時間的光譜峰形大致相同，整體趨勢類似，可能是因?yàn)樗苽涞孽r切獼猴桃片均為同品種、同批次.在掃描波數(shù)范圍4 000～12 000 cm-1內(nèi)包含非常豐富的光譜吸收信息，在10 220 cm-1、9 340 cm-1、8 375 cm-1、7 900 cm-1、6 945 cm-1、5 940 cm-1、5 160 cm-1等處可觀察到明顯的波谷或波峰形成.隨著光譜曲線的增多，不同冷藏時間鮮切獼猴桃片的近紅外光譜重合交叉比較嚴(yán)重，較難直接從光譜曲線中區(qū)分不同冷藏時間的獼猴桃片.

圖2 獼猴桃片冷藏過程中的原始吸收光譜

圖3和4分別為鮮切獼猴桃片冷藏0天和12天的原始吸收光譜圖.除冷藏時間不同，其他環(huán)境條件均相同，可以看到在5 500～5 000 cm-1、7 000～6 500 cm-1、8 000～7 500 cm-1處兩光譜圖存在明顯差異.這可能是由于獼猴桃片冷藏過程中，微生物生長繁殖，生化酶解，果片呼吸代謝等活動致使果片品質(zhì)尤其是總酸含量、pH值、總糖含量、Vc含量、可溶性固形物含量、硬度等理化品質(zhì)產(chǎn)生明顯變化，導(dǎo)致不同貯藏時間獼猴桃片在波峰或波谷處的吸收強(qiáng)度不同，初步推斷基于近紅外光譜技術(shù)可對不同冷藏時間的鮮切獼猴桃片進(jìn)行區(qū)分，建立冷藏過程中鮮切獼猴桃片微生物污染水平的近紅外模型是可行的.

圖3 獼猴桃片冷藏0天的原始吸收光譜

圖4 獼猴桃片冷藏12天的原始吸收光譜

2.3 鮮切獼猴桃片冷藏過程中微生物污染水平近紅外模型建立

2.3.1 光譜預(yù)處理和光譜區(qū)間選擇

采用PLSR方法建模，利用OPUS 7.0軟件探究不同光譜預(yù)處理方法對PLSR模型性能的影響，從而找到最優(yōu)預(yù)處理方法以及對應(yīng)最佳建模光譜區(qū)間.不同光譜預(yù)處理的冷藏條件下鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)的PLSR建模結(jié)果如表1所示，圖5為最佳預(yù)處理(減去一條直線)優(yōu)選波段光譜圖.一般來說,較優(yōu)的模型有較高的R2、較低的RMSECV和RMSEP、RMSECV與RMSEP比值越接近1 越好.可以看出采用“減去一條直線”的預(yù)處理方法得到的RMSECV值最小，誤差最小，即通過減去一條直線預(yù)處理在9 403.2～4 246.5 cm-1波段所建立的模型最佳.

表1 不同預(yù)處理對菌落總數(shù)校正結(jié)果及優(yōu)選波長范圍

2.3.2 校正集和檢驗(yàn)集樣品劃分

表2為校正集和檢驗(yàn)集樣品隨機(jī)劃分結(jié)果.可以看出，校正集和檢驗(yàn)集獼猴桃片樣品菌落總數(shù)真值分布范圍廣，代表性強(qiáng)，并且樣品檢驗(yàn)集菌落總數(shù)范圍包含在校正集范圍內(nèi)，用該校正集所建立的PLSR模型可以適用于檢驗(yàn)集進(jìn)行外部檢驗(yàn)，以便分析模型的預(yù)測性能.

表2 樣品集劃分結(jié)果

2.3.3 留一交互驗(yàn)證法建立PLSR校正模型

經(jīng)過交互驗(yàn)證，去除1條異常數(shù)據(jù)后得到優(yōu)化參數(shù).通過所得優(yōu)化參數(shù)再次進(jìn)行“留一法” 交互驗(yàn)證得到優(yōu)化PLSR校正模型.模型性能評價(jià)指標(biāo)值：RMSECV=0.473，RCV2=92.86，RPD=3.74.圖6為校正集中獼猴桃片菌落總數(shù)PLSR模型預(yù)測值和稀釋平板法測定真實(shí)值擬合圖.可以看出，菌落總數(shù)模型預(yù)測值與真實(shí)值擬合性好，相關(guān)性高，模型預(yù)測可靠性強(qiáng).

2.3.4 檢驗(yàn)集檢驗(yàn)PLSR模型

模型預(yù)測性能不能僅取決于校正過程的內(nèi)部交互驗(yàn)證，還得通過未參與建模的未知(外部)樣品進(jìn)行驗(yàn)證.為了更好的評價(jià)PLSR校正模型的預(yù)測性能，利用已建立的近紅外校正模型對檢驗(yàn)集未知樣品菌落總數(shù)進(jìn)行預(yù)測分析.檢驗(yàn)集檢驗(yàn)校正模型調(diào)整模數(shù)并剔除3個校正集異常數(shù)據(jù)后使模型RMSEE進(jìn)一步降低至0.413，RE2=95.07，模型預(yù)測更準(zhǔn)確，結(jié)果如圖7所示.

圖7 菌落總數(shù)校正模型擬合值與真值散點(diǎn)圖

將調(diào)整優(yōu)化后的模型繼續(xù)進(jìn)行檢驗(yàn)集檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3個檢驗(yàn)集異常數(shù)據(jù)，剔除后得到最佳PLSR模型.檢驗(yàn)結(jié)果顯示：預(yù)測值與真值擬合較好，RMSEP=0.389，誤差范圍合理，RP2=95.81，表明該模型預(yù)測效果極佳，結(jié)果如圖8所示.

圖8 菌落總數(shù)檢驗(yàn)集檢驗(yàn)預(yù)測值與真值散點(diǎn)圖

對檢驗(yàn)集近紅外光譜預(yù)測值進(jìn)行殘差分析如圖9所示.光譜殘差值均小于0.15，PRESS小于0.2，殘差分布較為均勻，模型預(yù)測較穩(wěn)定，可以得到很好的預(yù)測分析效果.綜上分析可知，基于近紅外光譜技術(shù)所建立的鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程菌落總數(shù)PLSR模型預(yù)測準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平變化的實(shí)時動態(tài)監(jiān)控.

圖9 菌落總數(shù)近紅外光譜殘差分布

3 結(jié)論

本研究基于傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)與偏最小二乘回歸建模方法的結(jié)合，對鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平變化進(jìn)行定量分析，同時建立鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平變化近紅外快速檢測模型.建立模型的最佳預(yù)處理方法為減去一條直線，最佳波數(shù)范圍為9 403.2～4 246.5 cm-1.最佳模型驗(yàn)證結(jié)果顯示：RP2=95.81，預(yù)測值與真值相關(guān)性高；RMSEP=0.389，誤差在可接受范圍；RPD=4.7(>3),驗(yàn)證模型可靠，可用該模型進(jìn)行預(yù)測；殘差分布均勻，檢驗(yàn)集光譜殘差平方和為0.125(<0.2)，預(yù)測性能強(qiáng).所得模型可對鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平變化進(jìn)行有效識別.該模型可用于鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中微生物污染水平變化無損、快速檢測，實(shí)現(xiàn)對鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中品質(zhì)變化進(jìn)行可靠的實(shí)時動態(tài)監(jiān)控，但由于模型對樣品的品種、批次等高要求，在實(shí)際應(yīng)用中仍需針對具體情況對模型進(jìn)行不斷的調(diào)試以達(dá)到檢測目的.