杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法在稻米蛋白質(zhì)檢測中的對比研究

秦琳 黃世群 仲伶俐 付成平 周虹 趙珊 向冰 雷紹榮

（四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，成都610066；第一作者：QinlinL＠126.com；*通訊作者：leishaorong2004＠163.com）

稻米是我國的傳統(tǒng)主食，其主要成分是淀粉和蛋白質(zhì)，在含水量為14%的稻米中，淀粉和蛋白質(zhì)含量分別為76.7%～78.4%和6.3%～7.8%[1-2]。稻米蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，必需氨基酸種類豐富，其生物價值、蛋白質(zhì)利用率等均高于小麥蛋白和玉米蛋白，是決定稻米營養(yǎng)品質(zhì)的主要指標[3-8]。目前，稻米蛋白質(zhì)含量的測定方法主要為凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法，其中，凱氏定氮法是檢測蛋白質(zhì)含量的標準檢驗方法，其準確度高、重現(xiàn)性好。但采用凱氏定氮法時，需要大量化學試劑（如濃硫酸、氫氧化鈉溶液和硼酸溶液等），不僅加大了檢測成本，且嚴重污染環(huán)境，對實驗員健康存在潛在危害[9-10]。相比之下，杜馬斯燃燒法具有環(huán)保和高效的優(yōu)勢，已被歐美、日本等發(fā)達國家在多個行業(yè)采用[11-12]。近幾年來，在我國也逐漸被應用到如谷類、豆類粗蛋白質(zhì)含量的測定中（NY/T 2007-2011[13]）。其測定原理是試樣在純氧（≥99.99%）環(huán)境中高溫燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮氣，形成的氮氣氣流通過熱導檢測器（TCD）進行檢測[14]，再乘以相應的轉(zhuǎn)換系數(shù)得到蛋白質(zhì)含量。

近幾年來，國內(nèi)關(guān)于杜馬斯燃燒法測定飼料粗蛋白[10，15]、油料粗蛋白[16]、土壤全氮[17-18]和食品（奶粉、牛奶、黃豆、肉類、人參等）中蛋白質(zhì)含量[9，19-21]的研究較多，結(jié)果表明杜馬斯燃燒法可以作為測定飼料、油料和食品中蛋白質(zhì)含量的常規(guī)檢測方法；但用于測定土壤全氮時，含氮量較低的土壤樣品測定結(jié)果準確度要低于凱氏定氮法[18]。杜馬斯燃燒法用于稻米蛋白質(zhì)的檢測報道較少，為此，本試驗采用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法同時對40個精米和10個糙米樣品的蛋白質(zhì)含量進行檢測，通過對兩種方法測定結(jié)果的精密度、準確度和相關(guān)性及檢測成本進行比較分析，探討杜馬斯燃燒法用于稻米蛋白質(zhì)檢測的可行性，以期為準確、高效測定稻米蛋白質(zhì)含量提供方法參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

40個精米和10個糙米樣品由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（成都）提供，為2018年不同水稻主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的水稻產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

rapid MAX N EXCEED型元素分析儀，德國Elementar公司生產(chǎn)；FOSS2400全自動凱氏定氮儀、消化爐，瑞典FOSS公司生產(chǎn)；AUY 220電子天平，日本島津公司生產(chǎn)，精度為0.1 mg。

1.2.2 試劑與氣體

濃硫酸；催化劑（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）；10 g/L硼酸溶液；400 g/L氫氧化鈉溶液；0.05 mol/L鹽酸標準滴定溶液，按照GB/T 601-2016《化學試劑 標準滴定溶液的制備》規(guī)定配制并標定；0.1%甲基紅乙醇溶液；0.1%溴甲酚綠乙醇溶液；氧化銅和Pt催化劑；ESAREGAINER；氧化鋁；五氧化二磷；氧氣（純度≥99.99%）；氦氣（純度≥99.99%）；標準品：硫酸銨，含 N 21.21%，純度≥99.99%，天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)；天冬氨酸，含 N 10.52%，純度≥98%（HPLC），SIGMA公司生產(chǎn)。

1.3 測定方法

1.3.1 凱氏定氮法

稱取待測樣品約0.4 g（準確至0.0001 g）于消化管中，加入 5 g 催化劑（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）和 10 mL濃硫酸，搖勻，在消化爐上420℃消化約1 h，待消煮液呈亮綠色并澄清透明后取下，冷卻后緩慢加入約20 mL水。待液體冷卻后，置于FOSS 2400全自動凱氏定氮儀上進行加堿蒸餾3.5 min，將試樣中的氨通過冷凝由硼酸溶液直接吸收，并用鹽酸標準溶液滴定硼酸吸收液，記錄鹽酸滴定體積，計算樣品中蛋白質(zhì)含量。每個樣品重復測定3次，同時做5份空白測定。分別稱取硫酸銨標準品 20.0、30.0、40.0、50.0 和 60.0 mg，進行蒸餾滴定，得標準曲線。

1.3.2 杜馬斯燃燒法

采用rapid MAX N EXCEED型元素分析儀進行測定。稱取待測樣品約300 mg（精確至0.1 mg）于坩堝中，置于自動進樣盤內(nèi)，在燃燒爐溫度達900℃以上、次級燃燒管溫度達900℃以上、還原管溫度達600℃以上、氧氣（純度≥99.99%）壓力達0.25 MPa、氦氣（純度≥99.99%）壓力達0.38 MPa，儀器自動進樣檢測，加氧時間為120 s，加氧流速為300 mL/min。每個樣品做3次重復測定，同時做5份空白測定。分別稱取天冬氨酸標準物質(zhì) 50.0、100.0、150.0、200.0 和 250.0 mg，上機檢測，得標準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較，采用Excel軟件進行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法的精密度及質(zhì)量控制比較

圖1 凱氏定氮法含氮量標準曲線

圖2 杜馬斯燃燒法含氮量標準曲線

凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)時，稱取不同質(zhì)量硫酸銨標準品，以稱樣量為橫坐標、總氮含量為縱坐標建立標準曲線。總氮含量范圍為4.11～12.5 mg，標準曲線為 y=0.2104 x-0.072，R2=0.9998（圖 1）。采用杜馬斯燃燒法時，稱取天冬氨酸標準物質(zhì)，以總氮含量為橫坐標，峰面積為縱坐標建立標準曲線?？偟糠秶鸀?～25 mg，標準曲線為 y=2638.9 x+299.3，R2=1（圖 2）。由此可見，兩種方法測定標準品時，方法穩(wěn)定，且回收率較高。

分別用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定了全麥粉和糙米標準品的蛋白質(zhì)含量、乙酰苯胺標準品的全氮含量，每個樣品重復測定6次。從表1可看出，兩種方法測定的全麥粉蛋白質(zhì)含量和乙酰苯胺全氮含量結(jié)果相同，凱氏定氮法測定的糙米蛋白質(zhì)含量與杜馬斯燃燒法接近；兩種方法測定的糙米蛋白質(zhì)含量均低于標準品真實值，回收率分別為99.0%和99.2%。比較兩種方法的RSD和RE值，可確定杜馬斯燃燒法具有較高的精密度，且準確度良好。

表1 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定3種標準品的全氮含量的結(jié)果（n=6）

2.2 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量比較

用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定了40個精米和10個糙米樣品中的蛋白質(zhì)含量。從表2可見，凱氏定氮法測定的40個精米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍為5.31%～7.39%，10個糙米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍為6.43%～7.83%，杜馬斯燃燒法測定的40個精米樣品和10個糙米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍分別為5.27%～7.35%和6.40%～7.89%；凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定的精米樣品結(jié)果比值（K/D）為0.996～1.036，糙米樣品為0.993～1.023。由此可見，兩種方法對精米和糙米樣品的檢測表現(xiàn)出一致性。對兩組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，可以看出兩種方法測定結(jié)果有29個樣品存在顯著性差異，其中有28個樣品的杜馬斯燃燒法測定結(jié)果低于凱氏定氮法（偏低的范圍為0.005%～0.035%），這表明采用杜馬斯燃燒法測定稻米蛋白質(zhì)含量其結(jié)果較凱氏定氮法偏低。這可能是其檢測步驟與凱氏定氮法不同所致。首先杜馬斯燃燒法是通過將試樣在純氧（≥99.99%）環(huán)境中高溫徹底燃燒，再根據(jù)熱導檢測器檢測產(chǎn)生氮氣氣流量來測得準確的氮含量，而凱氏定氮法檢測氮含量需經(jīng)標準酸溶液滴定量來算出，滴定終點以顏色判斷，由于儀器靈敏度不同，可能會因酸滴定過量而使得檢測值偏高；其次杜馬斯燃燒法檢測過程從進樣到出結(jié)果是在完全密閉的系統(tǒng)中完成的，而凱氏定氮法的樣品在稱樣后需經(jīng)消煮、蒸餾和滴定，這3個過程不是在完全密閉和連續(xù)的體系中完成，可能存在NH3污染使得測定結(jié)果較凱氏定氮法稍高。

由圖3和圖4可看出，精米和糙米樣品用凱氏定氮法測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為0.02%～1.70%和0.20%～1.50%，杜馬斯燃燒法測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，兩種檢測方法變異系數(shù)均小于5%，穩(wěn)定性都很高。但相比較而言，杜馬斯燃燒法精密度和穩(wěn)定性更優(yōu)于凱氏定氮法。

2.3 兩種方法的相關(guān)性分析

在對杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量進行比較的基礎(chǔ)上，對兩種方法測定結(jié)果的相關(guān)性進行分析。由圖5和圖6可見，兩種方法測定精米蛋白質(zhì)結(jié)果間均存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9858），糙米測定值也存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9788）。

2.4 兩種方法的檢測成本對比

檢測成本是除精密度和準確度之外，評價一項檢測方法可行性的重要指標。本試驗中，兩種方法的精米和糙米蛋白質(zhì)測定次數(shù)為50×3=150，標準品測定次數(shù)為3×6=18；凱氏定氮法的硫酸銨測定次數(shù)為5，杜馬斯燃燒法的冬氨酸測定次數(shù)為5；空白測定次數(shù)為5。

杜馬斯燃燒法僅需稱樣就可上機檢測，且試劑耗材不用配制；而凱氏定氮法檢測前需要配制大量化學試劑，需要消煮樣品，且消煮過程繁瑣費時，蒸餾滴定時使用的酸堿對實驗人員和環(huán)境都有較大危害。由表3可看出，完成本試驗中所有樣品的檢測，杜馬斯燃燒法僅需17.8 h，且1名實驗員就可完成；而凱氏定氮法需39.3 h，2名實驗員。由此可見，基于降低時間、人工成本和環(huán)保的角度來說，杜馬斯燃燒法更具有優(yōu)越性。

3 結(jié)論

杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法均能準確測定出稻米蛋白質(zhì)含量，且精密度和準確度都符合要求。但相較于傳統(tǒng)的凱氏定氮法，杜馬斯燃燒法在稻米蛋白質(zhì)檢測中更具優(yōu)勢。對全麥粉標準品進行蛋白質(zhì)檢測時，杜馬斯燃燒法的RSD為0.10%，精密度高于凱氏定氮法；對糙米標準品進行蛋白質(zhì)檢測時，杜馬斯燃燒法的RE為0.8%，準確度優(yōu)于凱氏定氮法；杜馬斯燃燒法測定精米和糙米樣品的變異系數(shù)分別為0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，低于凱氏定氮法；兩種方法測定精米蛋白質(zhì)結(jié)果間均存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9858），糙米測定值也存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9788）。在檢測成本方面，完成本試驗中所有樣品的檢測，杜馬斯燃燒法所需時間和人力都約是凱氏定氮法的1/2，上機檢測前僅需稱樣，免去了消煮、配制試劑等諸多繁瑣程序。在環(huán)境保護方面，杜馬斯燃燒法不使用強酸強堿，少污染，對人體健康危害輕，是一種環(huán)保和高效的檢測方法。但其能否完全代替凱氏定氮法還需要進一步研究。

表2 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定稻米蛋白質(zhì)含量

表3 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法的檢測成本比較

圖3 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定精米蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)

圖4 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定糙米蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)

圖5 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系

圖6 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定糙米蛋白質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系