PPAR-γ介導(dǎo)FAK在肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移調(diào)控中的機(jī)制研究

張德信,胡勁松,李少軍,張永紅,王 珂,李滿祥

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710004;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:dexin1994@mail.xjtu.edu.cn)

在肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)進(jìn)展過程中,肺血管重構(gòu)是其重要的病理基礎(chǔ),而血管內(nèi)皮損傷后所致的肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)向內(nèi)膜遷移,最終致使內(nèi)膜增厚被認(rèn)為是PAH主要病理機(jī)制之一[1]。所以,抑制PASMCs遷移,就可以抑制PAH的發(fā)生和發(fā)展。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化是細(xì)胞遷移及侵襲過程中重要因素,其功能在腫瘤的侵襲機(jī)制中得到廣泛的研究[2]。FAK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的吸附、肌動蛋白聚合和骨架重組等生理過程,從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。在PAH發(fā)病機(jī)制中,FAK是否參與平滑肌細(xì)胞遷移,需要進(jìn)一步研究證實。本研究利用PDGF-BB刺激PASMCs,促進(jìn)其受體PDGF-βR磷酸化,再分別給予FAK拮抗劑Y15及PPAR-γ激動劑羅格列酮,觀察不同干預(yù)對于PASMCs遷移的影響,并檢測激活PPAR-γ后,PDGF-βR及FAK(Tyr397)磷酸化水平的變化,證實PPAR-γ、PDGF-βR和FAK在平滑肌細(xì)胞遷移中的關(guān)系。進(jìn)一步研究PASMCs遷移的分子調(diào)控機(jī)制,探索抑制PASMCs遷移的分子通路,為PAH靶向治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

清潔級4-6周雄性SD大鼠,體質(zhì)量150-200 g,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。青霉素(哈爾濱制藥廠),鏈霉素(華東制藥廠),0.25%胰酶、DMEM-12培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(美國HyClone公司);兔抗大鼠α-SMA(美國Abcam公司);DAB顯色試劑(北京中山生物技術(shù)公司);預(yù)鋪Ma-trigel膠的Transwell小室(美國Corning公司);重組人血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)、抗p-PDGF-βR(Tyr751,美國Cell Signaling公司);抗p-FAK(Tyr397)抗體(美國Life Technologies);1,2,4,5-苯四胺鹽酸鹽(Y15,美國sigma公司);Rosiglitazone(美國Cayman公司)。

1.2 大鼠PASMCs的原代培養(yǎng)、鑒定

頸椎脫臼法處死SD大鼠,無菌分離肺動脈中膜層,剪切后的組織塊貼壁于培養(yǎng)瓶,加入DMEM-12培養(yǎng)基(含20% FBS),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。組織塊長出細(xì)胞后,根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、免疫組化檢測血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志基因α-SMA的表達(dá),鑒定PASMCs。取第3-7代細(xì)胞用于實驗。

1.3 實驗分組及處理

取傳代培養(yǎng)3-7代細(xì)胞用于實驗,接種PASMCs(約5×104/孔)于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度約40%-60%時,換用無血清DMEM-12培養(yǎng)基,同步化處理24 h,將細(xì)胞分為CON組、PDGF-BB組、Y15組和ROSI組。CON組:加入含10% FBS的高糖DMEM-12培養(yǎng)基,不加入刺激因子及抑制劑;PDGF-BB組:根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,細(xì)胞同步化后加入20 ng/ml PDGF-BB刺激1 h,裂解細(xì)胞,提取蛋白,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。Y15組:同步化后加入PDGF-BB(20 ng/ml)預(yù)刺激1 h,再加入FAK抑制劑Y15(10 μmol/L)刺激2 h后裂解細(xì)胞,提取蛋白,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(TYR397)磷酸化水平。ROSI+PDGF-BB組:依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,同步化后加入羅格列酮10 μmol/L預(yù)處理1 h后加入20 ng/ml的PDGF-BB刺激1 h,收集細(xì)胞,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。

1.4 劃痕實驗

將2×106個PASMCs接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)至90%的融合狀態(tài),用10 μl Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕,按實驗分組加入相應(yīng)試劑,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h,在0、48 h取樣拍照,進(jìn)行組間比較。隨機(jī)選擇3個區(qū)域,計算遷移率。遷移率(%)=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.5 細(xì)胞遷移實驗

采用Transwell培養(yǎng)板進(jìn)行體外細(xì)胞遷移實驗:將Transwell放在24孔板內(nèi),細(xì)胞計數(shù)后,配制細(xì)胞懸液;在上室每孔加入100 μl DMEM-12無血清培養(yǎng)基;下腔室中加入500 μl含有100 ml/L FBS條件培養(yǎng)基;在上室每孔加入相應(yīng)干預(yù)因子的細(xì)胞1.0×105個,孵育24 h;顯微鏡下觀察。200倍高倍視野計數(shù)遷移至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù),反映PASMCs遷移能力。隨機(jī)計數(shù)3個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù),取平均值進(jìn)行組間比較,實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)磷酸化程度

將各組細(xì)胞裂解液提取的蛋白樣品用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度,稀釋后用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,濕法轉(zhuǎn)印,ECL化學(xué)發(fā)光顯色,暗室中拍片,以β-actin作為內(nèi)參,將結(jié)果掃描成電子圖像,以Quantity One分析軟件(Bio-Rad,USA)分析圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PASMCs的培養(yǎng)及鑒定

大部分組織塊接種培養(yǎng)3 d左右,組織塊周圍有細(xì)胞呈放射狀生長,早期細(xì)胞形態(tài)大小不一。經(jīng)反復(fù)傳代及純化,第4代時平滑肌細(xì)胞純度可達(dá)95%以上。顯微鏡下單個平滑肌細(xì)胞呈梭形或帶狀,有多個細(xì)胞突起。細(xì)胞生長致密時平行排列成束,部分重疊。培養(yǎng)第5代的細(xì)胞,經(jīng)特異的α-actin免疫化學(xué)染色后證實為平滑肌細(xì)胞。

2.2 劃痕實驗檢測PASMCs遷移結(jié)果

PDGF-BB組PASMCs經(jīng)20 ng/ml PDGF-BB干預(yù)48 h后,遷移能力明顯提高,表現(xiàn)為劃痕區(qū)域的面積變化(77.3%±4.2%)高于CON組(61.3%±3.5%,P<0.05)。經(jīng)PDGF-BB和FAK抑制劑Y15共同處理后,Y15組劃痕區(qū)域的面積較PDGF-BB干預(yù)組變化明顯減小(72.7%±4.7%vs77.3%±4.2%,P<0.05);經(jīng)PDGF-BB和羅格列酮共同處理后,ROSI組劃痕區(qū)域的面積變化較PDGF-BB干預(yù)組明顯減小(75.3%±4.04%vs77.3%±4.2%,P<0.05),但與Y15組比較,劃痕區(qū)域的面積變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(75.3%±4.04%vs72.7%±4.70%,P>0.05,見圖1)。

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05圖1 劃痕試驗檢測各組細(xì)胞在Y15干預(yù)、激活PPAR-γ后對于PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMCs遷移的影響Figure 1 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on PDGF-BB-induced migration of PASMCs by scratch test

2.3 Transwell遷移小室實驗結(jié)果

PDGF-BB可明顯增加PASMCs細(xì)胞穿過微孔濾膜的能力,與CON組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(70.7±3.1vs48.7±2.2,P<0.05)。而在上室加入PDGF-BB和FAK抑制劑后,Y15組細(xì)胞穿膜數(shù)較PDGF-BB組明顯減少(70.7±3.1vs51.0±1.3,P<0.05);經(jīng)PDGF-BB和羅格列酮共同處理后,ROSI組細(xì)胞穿膜數(shù)較PDGF-BB組也明顯減少(70.7±3.1vs48.7±2.9,P<0.05),但與Y15組比較,穿膜細(xì)胞數(shù)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(51.0±1.3vs48.7±2.9,P>0.05,見圖2)。

2.4 Western blot檢測PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平

PDGF-BB可明顯提高PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化程度。與CON組比較,PDGF-BB組p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給予Y15干預(yù)后,同PDGF-BB組比較,Y15組p-PDGF-βR表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而p-FAK(Tyr397)則明顯降低(P<0.05);給予羅格列酮干預(yù)后,與PDGF-BB組比較,p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表達(dá)水平均降低,差異具有顯著性(P<0.05,見圖3)。

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05圖2 Transwell遷移小室檢測對各組細(xì)胞在Y15干預(yù)、激活PPAR-γ后對于PDGF-BB誘導(dǎo)的PASMCs侵襲能力的影響Figure 2 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on invasive ability of PAGF-BB-induced PASMCs by Transwell migration chamber assay

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05；與Y15組比較，△P<0.05圖3 Western blotting檢測Y15干預(yù)、激活PPAR-γ后，p-PDGF-βR、p-FAK(Y397)磷酸化水平的變化Figure 3 Changes of phosphorylation levels of p-PDGF-βR and p-FAK(Y397) after Y15 intervention and activation of PPAR-γ by Western blotting

3 討論

PASMCs遷移和增殖是PAH發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),抑制PASMCs遷移和增殖是目前治療PAH發(fā)生和發(fā)展的重要策略。本課題組近期的研究結(jié)果提示,通過激活PPAR-γ,可上調(diào)血紅素加氧酶-1(HO-1)蛋白的表達(dá),上調(diào)的HO-1又可上調(diào)周期蛋白p21(WAF1)的表達(dá),最終可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[3]。本實驗利用羅格列酮激活PPAR-γ后,研究其對于PASMCs遷移作用及可能機(jī)制。PASMCs的遷移需要化學(xué)趨化劑,再通過多種分子通路,使PASMCs向血管內(nèi)膜遷移,參與血管重構(gòu)。PDGF-BB就是最為重要的驅(qū)化劑之一[4]。本實驗利用PDGF-BB作為趨化因子,刺激PASMCs遷移,研究激活PPAR-γ后對于PASMCs遷移的影響及可能的機(jī)制。本實驗結(jié)果提示,激活PPAR-γ可明顯抑制PASMCs的遷移,這種抑制作用部分機(jī)制可能是通過抑制PDGF-βR磷酸化,進(jìn)一步抑制FAK(Tyr397)磷酸化水平而實現(xiàn)的。

PAH病因復(fù)雜,參與其發(fā)病的因素包括肺血管收縮與重構(gòu),肺血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖,血栓形成及遺傳基因變異等[5]。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移是其重要環(huán)節(jié),這一過程與PPAR-γ關(guān)系密切[6]。研究發(fā)現(xiàn),PAH患者的PPARγ的表達(dá)無論在基因水平還是在蛋白水平都有明顯降低;在對重癥PAH的肺組織進(jìn)行抗PPARγ單克隆抗體的免疫染色時,發(fā)現(xiàn)肺血管的叢樣病變處PPAR-γ的表達(dá)明顯減少[7]。在PAH動物模型中,激活PPAR-γ后,肺動脈壓力明顯降低,這一作用是通過降低PASMCs的增殖和遷移實現(xiàn)的[8]。

FAK在多種細(xì)胞的遷移、增殖、分化、凋亡等的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用,是細(xì)胞周期的正向調(diào)節(jié)因子。過度表達(dá)的FAK不但可以增加DNA的合成,促進(jìn)細(xì)胞增殖,還可以促進(jìn)細(xì)胞遷移;突變的FAK則可以抑制細(xì)胞遷移[9]。目前研究較多的是FAK在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的作用[10]。FAK磷酸化是調(diào)控細(xì)胞遷移的基礎(chǔ),而在所有FAK磷酸化位點中,FAK(Tyr397)的磷酸化處于核心位置,其磷酸化后可催化FAK的Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861和Tyr925等位點磷酸化,最終使FAK完全活化[11]。研究證實,血小板衍生生長因子PDGF-BB可引起血管平滑肌細(xì)胞FAK表達(dá)升高與活化,而活化的FAK可通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞遷移及增殖[12]。而這一作用機(jī)制是否參與到PAH的形成過程中,并沒有得到證實。本實驗結(jié)果提示,PASMCs經(jīng)PDGF-BB干預(yù)后,遷移能力明顯提高,表現(xiàn)為劃痕區(qū)域的面積變化和Transwell遷移小室遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于CON組,且PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平明顯較CON組提高,提示PDGF-BB可通過促進(jìn)PDGF-βR磷酸化,進(jìn)而提高FAK磷酸化水平,促進(jìn)PASMCs遷移。給予FAK拮抗劑Y15干預(yù)后,PASMCs遷移能力減弱,同時伴有FAK(Tyr397)磷酸化水平明顯降低,PDGF-βR磷酸化水平無明顯變化,提示磷酸化的FAK參與到PASMCs遷移過程中。再次激動PPAR-γ后,PASMCs遷移再次受到抑制,而PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平同PDGF-BB組比較顯著降低。本實驗結(jié)果提示,激動PPAR-γ可以抑制肺動脈高壓的形成,部分原因可能是通過抑制PDGF-βR磷酸化,進(jìn)而抑制FAK的磷酸水平,最終抑制PASMCs的遷移來實現(xiàn)的。

盡管本實驗結(jié)果證實了激動PPAR-γ抑制PASMCs遷移的可能機(jī)制,但激動PPAR-γ抑制PASMCs遷移尚存在多個信號通路、關(guān)鍵的靶蛋白及對應(yīng)的靶基因[13,14],仍需通過相關(guān)抑制劑或基因沉默干擾技術(shù)進(jìn)一步研究,從而更好地理解PPAR-γ在PAH治療中的作用機(jī)制。