小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

李紅霞,李瑞嬌,張汝月,張引紅,郭興萍*

(1山西省生殖科學(xué)研究所,出生缺陷與細胞再生山西省重點實驗室,太原 030006;2山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;*通訊作者,E-mail:sxxp555@163.com)

人子宮內(nèi)膜是一個高度再生的組織,女性一生大約要經(jīng)歷子宮內(nèi)膜400多個周期的脫落和再生。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜這種巨大的再生能力被認為與人類子宮內(nèi)膜干細胞有直接關(guān)系[1],受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。目前,子宮內(nèi)膜干細胞分類較為多樣化,包括子宮內(nèi)膜細胞側(cè)群(side population, SP)、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞、月經(jīng)血來源的干細胞等[2],其中子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞因其數(shù)量較多,生物學(xué)特性明顯等受到更多關(guān)注[3]。但其取材的特殊性對該研究的多樣化和深入程度造成了一定的影響。

小鼠雖然不具備靈長類動物的月經(jīng)周期,但也具有規(guī)律的動情周期,并且其動情周期伴隨著子宮內(nèi)膜細胞的增生及衰亡[4]。另外,Chan等[5]通過標記滯留技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),小鼠子宮中也含有子宮內(nèi)膜干細胞。參考這種情況,本實驗獲取小鼠子宮組織,分離培養(yǎng)得到小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞,并對該細胞進行鑒定,為薄型子宮內(nèi)膜小鼠的內(nèi)膜修復(fù)提供材料,也為治療人薄型子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜受損的相關(guān)疾病提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠子宮組織

小鼠子宮組織來源于C57BL/6J經(jīng)產(chǎn)離乳小鼠(生了小鼠,小鼠離乳后的母鼠),SPF級,購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SCXK(晉)2015-0001)

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)液MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)、L-Glutamine購自STEMCELL Technologies(Canadian)公司，膠原酶Ⅲ、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、青鏈霉素混合液(100×)、臺盼藍染色液(0.4%)、CCK-8試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，CELLSAVING無血清細胞凍存液購自蘇州新賽美生物科技有限公司。流式抗體(CD29-APC/CD45-PerCP-Cy5.5/CD73-PE-Cy7/CD105-APC/CD117-APC)購自eBioscience公司(USA)。

1.3 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分離

脫頸處死小鼠,75%酒精消毒,取雙側(cè)子宮,置于1×PBS中清洗,剪去系膜等。在PBS中將子宮剪成1 mm×1 mm左右塊狀,將小塊轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管,加入酶混合液(0.1%膠原酶+0.08%胰酶),37 ℃水浴45 min,加入含10% FBS的培養(yǎng)液中止消化,將消化后所有的液體吸取至15 ml離心管,培養(yǎng)箱放置待用。管中沉淀再次加入酶混合液，37 ℃恒溫水浴45 min，加入含10% FBS的培養(yǎng)液中止消化，兩次消化所得液體混合，用70 μm細胞過濾器過濾液體。將過濾后的液體1 000 r/min離心10 min。棄上清，加培養(yǎng)液重懸，再次離心。所得沉淀即為子宮內(nèi)膜細胞，取培養(yǎng)液重懸計數(shù)后即可進行培養(yǎng)。

1.4 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)

將細胞計數(shù),置于25 ml培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5% CO2,10% O2,85% N2。培養(yǎng)第7天,鏡下觀察若細胞80%-90%融合,則進行1 ∶2或者1 ∶3傳代,若細胞融合過低,則進行半量換液,第10天鏡下觀察傳代。傳代時,PBS沖洗3次,沖去殘留的培養(yǎng)液,用2.5%胰蛋白酶消化3 min,加入含10% FBS培養(yǎng)液中止消化,反復(fù)吹打瓶壁,將所獲單細胞懸液1 000 r/min,離心10 min。棄上清,完全培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù)后培養(yǎng)。

1.5 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞生長曲線測定

取生長狀態(tài)良好的第3代細胞(P3)和第5代細胞(P5),分別于對數(shù)期消化后細胞培養(yǎng)液重懸,制成2×104/ml細胞懸液。參照CCK-8說明書,將細胞接種在96孔板,每孔100 μl,加樣孔數(shù)為7×9孔。96孔板的周邊孔分別加入細胞培養(yǎng)液100 μl,以保持環(huán)境濕潤(CCK8加樣示意圖見圖1)。37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為5% CO2、10% O2、85% N2。細胞培養(yǎng)1，2，3，4，5，6，7 d,每天設(shè)7個復(fù)孔，2個空白對照孔。測定前實驗孔每孔加入10 μl CCK-8，孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長吸光度值。

圖1 CCK-8加樣示意圖Figure 1 CCK-8 sketch map of loading

1.6 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表面標志物表達

流式細胞儀鑒定小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表面標記,取生長狀態(tài)良好的小鼠子宮內(nèi)膜干細胞P3和P5,消化后用PBS重懸,制成1×108/ml單細胞懸液,取流式管,每管加入100 μl細胞懸液,共6管。第1管為空白對照,剩余5管參考說明書分別加入流式抗體(CD29-APC-0.625 μl/CD45-PerCP-Cy5.5-0.3 μl/CD73-PE-Cy7-0.625 μl/CD105-APC-0.625 μl/CD117-APC-0.625 μl),混勻,4 ℃孵育30 min，上機檢測。

1.7 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的凍存

小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞凍存采用新賽美無血清細胞凍存液。凍存步驟如下:常規(guī)方法收集對數(shù)期的貼壁細胞置于離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄上清,收集沉淀,根據(jù)細胞數(shù)加入新賽美無血清細胞凍存液,調(diào)整細胞終濃度為5×105-1×107/ml。輕柔地混勻細胞,制成細胞混合液,分裝于凍存管,每管1 ml。-80 ℃保存。

1.8 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇

從冰箱中取出凍存的細胞，立即放入37 ℃水浴鍋中快速解凍。待凍存管中細胞混合液完全融化后，立即加入1 ml細胞培養(yǎng)基于冷凍管中與細胞混合。將混合液轉(zhuǎn)移至含有約5 ml細胞培養(yǎng)基的離心管中，混勻，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集沉淀。加入適量的新鮮細胞培養(yǎng)基，輕柔混勻，取0.1 ml細胞懸液與0.4%臺盼藍染色液0.9 ml混勻，3 min內(nèi)用細胞計數(shù)板計數(shù)死細胞與活細胞，其中死細胞被染成藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀?；罴毎?%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))。

細胞計數(shù)后，將重懸的干細胞懸液1.9 ml平均分裝轉(zhuǎn)入2個25 ml培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至5 ml，37 ℃，5% CO2、10% O2、85% N2培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)學(xué)觀察

原代分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜干細胞24 h置于倒置顯微鏡下觀察,1 d可見細胞基本貼壁,少量梭形細胞和多角形細胞,多為圓形細胞。隨著時間延長,3-4 d,大多為梭形細胞,到6-7 d,可見不同大小的集落,呈漩渦狀。繼續(xù)觀察,若7 d左右融合率過低,半量換液后繼續(xù)培養(yǎng),大約10 d達到80%-90%融合,可見細胞排列成網(wǎng)狀。原代含有部分錯落的圓形細胞(小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng),見圖2)。

A.培養(yǎng)1 d;B.培養(yǎng)3 d;C.培養(yǎng)7 d;D.培養(yǎng)10 d圖2 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng) (×100)Figure 2 Culture of mesenchymal stem cell from mice endometrium (×100)

2.2 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的生長與傳代

隨著傳代次數(shù)的增多,圓形細胞逐漸消失,細胞形態(tài)越來越統(tǒng)一,傳代細胞較扁平,呈極性排列。各代間細胞形態(tài)基本無變化(見圖3)。

2.3 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞增殖曲線

以時間(天數(shù))為橫軸，OD值為縱軸，繪制小鼠子宮內(nèi)膜干細胞增殖曲線。小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞生長曲線，傳代培養(yǎng)潛伏期為1-3 d，增長較為緩慢。對數(shù)期為4-6 d，細胞進入快速增長階段。對數(shù)期后增長速度逐漸下降。P3和P5兩代細胞增殖曲線無明顯區(qū)別(見圖4)。

2.4 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表面標志物表達

對P3，P5小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞進行流式細胞術(shù)檢測，小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表面標記物流式細胞儀檢測結(jié)果見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P3細胞尚未達到比較理想的純化狀態(tài)，P5細胞純化效果較好。小鼠子宮內(nèi)膜干細胞第5代高表達CD29(97.7%)，CD73(85.2%)，CD105(99.8%)，低表達CD45(5.6%)，不表達CD117(0.1%)。

A. 第3代細胞 B.第5代細胞圖3 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng) (×100)Figure 3 Observation of mesenchymal stem cells from mice endometrium after different passages (×100)

圖4 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞增殖曲線Figure 4 Proliferation curve of mesenchymal stem cell from mice endometrium

2.5 小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的凍存與復(fù)蘇

臺盼藍法計數(shù)(細胞計數(shù)板),細胞復(fù)蘇后存活率達到96%以上,生長狀態(tài)良好,增殖能力強,與凍存前細胞活力無明顯差異。

圖5 P5流式細胞儀分析小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表面標記物Figure 5 Phenotypic analysis of mesenchymal stem cell from mouse endometrium by flow cytometry

3 討論

1978年,Prianishnikov[6]首次提出子宮內(nèi)膜干細胞這一概念,人類開始意識到,具有強大再生能力的子宮內(nèi)膜干細胞在子宮內(nèi)膜周期性的增生和剝落中扮演著不可忽視的重要角色。2004年,Chan等[7]首次從女性子宮內(nèi)膜組織中分離出人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞,并通過單克隆細胞培養(yǎng)、相關(guān)干細胞因子的表達等證明子宮內(nèi)膜中確實存在子宮內(nèi)膜干細胞。2009年,Gargett等[8]通過再次確定人子宮內(nèi)膜干細胞巨大的再生能力及體外誘導(dǎo)分化等實驗,確認子宮內(nèi)膜干細胞不僅在子宮內(nèi)膜再生干預(yù)方面有重大作用,也因其易于獲得,從而為基于間充質(zhì)干細胞的細胞療法提供了一種新的可能。近年來,經(jīng)血源性干細胞逐漸走入大眾視野,不僅取材方便,獲得過程對供體無手術(shù)風(fēng)險,更因其比分泌期子宮內(nèi)膜干細胞具有更強的增殖能力和自我更新能力得到了行業(yè)的廣泛關(guān)注[9]。將源于經(jīng)血的干細胞作為細胞治療的種子細胞移植所進行的修復(fù)研究也已涉及心肌梗死、Duchenne型肌營養(yǎng)不良、Ⅰ型糖尿病、結(jié)腸炎及子宮內(nèi)膜修復(fù)等多個方向及領(lǐng)域[10-12]。

由于倫理學(xué)、有創(chuàng)采集等多種原因,人體作為子宮內(nèi)膜干細胞的供體,深入研究有諸多不便。小鼠作為應(yīng)用最多的實驗動物,有著眾多不可忽視的優(yōu)勢。雖然月經(jīng)是人和靈長類動物特有的生殖特性,小鼠屬于嚙齒類動物,不具備這一特性。但是小鼠具有和人類相似的子宮結(jié)構(gòu)和規(guī)律的動情周期。小鼠的動情周期為4-5 d,每個動情周期都伴隨著子宮細胞的增生和凋亡[4]。同時2006年Chan等[5]已通過標記滯留細胞(label retaining cells,LRCs)首次確定C57BL/6J小鼠子宮中含有子宮內(nèi)膜干細胞。胡菲菲等[13]從生育期小鼠4個動情期(動情前期、動情期、動情后期、動情間期)和小鼠產(chǎn)后子宮內(nèi)分離子宮內(nèi)膜干細胞,并比較這些子宮內(nèi)膜干細胞數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后小鼠子宮中SP細胞明顯多于正常未孕的小鼠。徐靜[14]通過Hoechst-SP法檢測小鼠產(chǎn)后第1,3,7,14,17.5,21,28,60天子宮內(nèi)膜SP細胞比率,發(fā)現(xiàn)第17.5天時的SP細胞比率達到峰值。新生小鼠約21 d離乳,考慮到動物福利的情況,綜合考慮,本實驗最終選擇產(chǎn)后21-23 d的C57BL/6J母鼠作為實驗材料,獲取子宮內(nèi)膜干細胞。

子宮內(nèi)膜分離消化的方法主要包括機械研磨法、剪碎法、酶消化法、組合法等多種方法[14,15],其中剪碎法和酶消化法組合為大多實驗室所認可。酶的使用又包括膠原酶、胰酶、DNA酶等。本實驗在經(jīng)歷了擠壓法獲得子宮內(nèi)膜、刮取法獲得子宮內(nèi)膜加少量肌層、全子宮剪碎消化分離培養(yǎng),膠原酶+DNA酶消化法、膠原酶加胰酶消化法等不同組合次數(shù)的摸索,最后確定選擇(0.1%膠原酶+0.08%胰酶)2次消化法,70 μm細胞過濾器過濾后可獲得較為純凈的子宮內(nèi)膜單細胞懸液。

目前,根據(jù)來源或者不同的分離手段將子宮內(nèi)膜干細胞主要分為:間充質(zhì)干細胞、上皮干細胞、SP干細胞、經(jīng)血源性干細胞、子宮內(nèi)膜再生細胞等[2]。常規(guī)貼壁分離培養(yǎng)所含細胞分為子宮內(nèi)膜上皮干細胞和間充質(zhì)干細胞。子宮內(nèi)膜上皮干細胞含量較少,約占子宮內(nèi)膜干細胞總數(shù)的5%,分離不易且體外培養(yǎng)困難[6]。間充質(zhì)干細胞含量較多,主要位于基質(zhì)和肌層交界處。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細胞來源于發(fā)育早期的中胚層[7],不同來源包括骨髓[16]、脂肪[17]、臍帶[18]等的間充質(zhì)干細胞都具有類似的特性。鑒此,本實驗選擇了STEMCELL Technologies公司的MesenCultTMExpansion Kit(Mouse)作為細胞培養(yǎng)液,該細胞培養(yǎng)液專為富集小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞設(shè)計,并配合低氧環(huán)境進行培養(yǎng),實驗發(fā)現(xiàn)在此環(huán)境下,子宮內(nèi)膜干細胞生長狀態(tài)良好,增殖明顯。

常規(guī)干細胞的鑒定包括形態(tài)觀察,克隆形成實驗,流式細胞儀對細胞表面標記進行分析、免疫組化鑒定等。本實驗結(jié)果顯示培養(yǎng)所獲子宮內(nèi)膜干細胞形態(tài)學(xué)特征與文獻報道[13]較為一致,且增殖力強。通過流式細胞儀對細胞表面標記進行分析是近年來應(yīng)用最為廣泛的一種鑒定手段。Deane等[19]實驗結(jié)果顯示,來源于成年小鼠子宮的間質(zhì)細胞高表達CD90和CD44,低表達CD45和EpCAM。Chan等[5]研究認為,小鼠子宮內(nèi)膜干細胞在表達sca-1、CD31、α-SMA的同時也表達雌激素受體(ERα)和Ki-67(增殖標志),不表達c-Kit。部分學(xué)者研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜干細胞中CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD140、CD146等均表達陽性[20,21]。李建國等[22]研究表明小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞高表達CD29和CD44,基本不表達CD45和CD11b,趙文秀等[23]研究顯示小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞高表達CD29和CD44,不表達CD34、CD45、CD11b、CD14。參考文獻及相關(guān)預(yù)實驗,本實驗最后決定選擇CD29、CD45、CD73、CD105、CD117(c-kit)作為鑒定標記,實驗結(jié)果顯示本實驗所培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜干細胞表達CD29,CD73,CD105,不表達CD45、CD117。通過以上實驗,可以確定本實驗所分離培養(yǎng)的為小鼠子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞。

子宮內(nèi)膜是對女性維持生理功能和生育功能有著重大意義的部分,也是輔助生殖領(lǐng)域影響胚胎著床的關(guān)鍵因素[24]。子宮內(nèi)膜干細胞的深入研究,對子宮內(nèi)膜功能改善、子宮疾病治療有著積極的影響。因此,在人類子宮內(nèi)膜研究較為受限的情況下,全方位研究小鼠子宮內(nèi)膜干細胞,為人類子宮內(nèi)膜干細胞的研究與應(yīng)用提供相關(guān)數(shù)據(jù)支撐。