褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

徐高青，李志強(qiáng)，王友元，王 軍，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省反芻動(dòng)物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin）是一種主要由松果體合成的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，能夠維持哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律[1-2]。褪黑素參與多種生理功能，包括抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管舒縮和癌癥預(yù)防[3-5]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是產(chǎn)生雄性激素的主要細(xì)胞，在精子發(fā)生和成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡與睪丸功能息息相關(guān)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞缺乏會(huì)使生精細(xì)胞大量凋亡，從而導(dǎo)致睪丸生精功能障礙[7]。研究表明，在小鼠睪丸內(nèi)注射褪黑素抑制了睪酮的合成和分泌，同時(shí)顯著降低了小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮水平以及睪酮合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因STAR、P450SCC（CYP11A1）和3β-HSD的表達(dá)水平[8-9]，但其對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加不同濃度褪黑素，利用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印跡（Western Blot）技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2表達(dá)水平，從而分析褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 實(shí)驗(yàn)選擇小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系（TM3，武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0234）作為研究對(duì)象。配制含有5%胎牛血清、2.5%馬血清和1%青霉素/鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液用于細(xì)胞的體外培養(yǎng)。在處理細(xì)胞時(shí)，為消除血清的強(qiáng)烈刺激，換用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，在對(duì)照組中直接加入培養(yǎng)液，不同濃度處理組中分別在培養(yǎng)液中加入1、10、100、1 000 ng/mL 的褪黑素（SIGMA，M5250-1G），培養(yǎng)36 h 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將TM3 細(xì)胞傳代至96 孔板，用不同濃度褪黑素處理36 h 后，使用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。每孔加入MTT 試劑（BioFroxx，3580MG250）20 μL；37℃孵育4 h 后，棄上清，加入150 μL DMSO（二甲基亞砜），振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在吸光度490 nm 處檢測(cè)細(xì)胞活力，選擇最佳處理時(shí)間點(diǎn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照凋亡檢測(cè)試劑盒（BD Pharmingen，556547）要求，將處理好的細(xì)胞用PBS 清洗后，使用胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，再次使用PBS 緩沖液清洗2～3 次，加入200 μL 1×Binding Buffer、PI 和FITC 各5 μL，充分混勻，37℃孵育15 min，再加入200 μL 1×Binding Buffer，過(guò)膜至流式管中，在1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 使用RNAiso Plus（TaKaRa，9109）進(jìn)行RNA 提取，根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。本實(shí)驗(yàn)所用基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，引物序列見表1。利用熒光定量PCR 儀檢測(cè)對(duì)照組和不同濃度褪黑素處理組凋亡相關(guān)基因及增殖相關(guān)基因表達(dá)。20 μL 反應(yīng)體 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、下游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，59℃退火34 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，95℃復(fù)性15 s。運(yùn)用 2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 Western Blot 收集處理后的細(xì)胞，加入蛋白裂解液進(jìn)行總蛋白提取，根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書（碧云天）進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)。配制15%聚丙烯酰胺凝膠，上樣進(jìn)行電泳，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件0.12 A 28 min。采用BSA 封閉1.5 h，1∶1 000 加入一抗，即兔抗BAX（abclonal，A12009）和BCL-2（abclonal，A11025），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗3 次，每次5 min。1∶10 000二抗（羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。最后用ECL 發(fā)光液顯影，用Tanon Gis 軟件進(jìn)行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參。

表1 基因引物

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較組間差異性，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組相比，10 ng/mL（P＜0.01）和100 ng/mL（P＜0.05）褪黑素均提高了小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力，1 000 ng/mL 褪黑素處理后，細(xì)胞活力無(wú)顯著性改變。

2.2 褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，10 ng/mL 褪黑素處理后，細(xì)胞凋亡率極顯著下降（P＜0.01）；100 ng/mL 褪黑素處理后細(xì)胞凋亡率顯著下降（P＜0.05）。1 ng/mL 和1 000 ng/mL褪黑素處理后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組差異不顯著。

圖1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力

圖2 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率

2.3 褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響由圖3 可知，與對(duì)照組相比，10 ng/mL 褪黑素下調(diào)了促凋亡基因BAXmRNA 表達(dá)水平（P＜0.01），上調(diào)了抑凋亡基因BCL-2mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01）。

圖3 凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2 mRNA 表達(dá)量

2.4 褪黑素對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞BAX 和BCL-2 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，10 ng/mL 褪黑素下調(diào)了BAX蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），上調(diào)了BCL-2 蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。

圖4 凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2 表達(dá)水平

3 討 論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中最重要的細(xì)胞之一，對(duì)精子的發(fā)生和睪丸發(fā)育具有重要作用。研究表明，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡嚴(yán)重影響動(dòng)物的繁殖性能[2]。近年來(lái)，褪黑素的抗凋亡作用已經(jīng)在多種細(xì)胞中被證明，但在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，褪黑素可降低小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，這與實(shí)驗(yàn)室前期在雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[10]。相關(guān)研究表明，褪黑素能夠通過(guò)其受體MT1 和MT2 抑制牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，并且可緩解由β-玉米赤霉烯醇和HT-2 毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[11-12]。Ma 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素降低了小鼠心肌細(xì)胞的凋亡水平以及血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的分泌水平，上調(diào)SIRT1和抑凋亡基因BCL-2表達(dá)，并下調(diào)促凋亡基因BAX、Caspase-3的表達(dá)。在化療實(shí)驗(yàn)中，褪黑素能夠降低睪丸細(xì)胞凋亡，對(duì)精子具有保護(hù)作用[14]。

對(duì)于褪黑素的抗凋亡機(jī)制，目前已有研究表明，褪黑素可通過(guò)Nrf2 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，提高線粒體膜電位（MMP）和BCL-2mRNA 和蛋白表達(dá)，降低Caspase-3 活性和促凋亡基因表達(dá)，減輕氯化鋁誘導(dǎo)的大鼠脾脹細(xì)胞凋亡[15]。此外，褪黑素還通過(guò)上調(diào)SIRT1表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而降低終板軟骨細(xì)胞的凋亡和鈣化[16]。

綜上所述，褪黑素能夠影響細(xì)胞的凋亡水平，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的生理過(guò)程。本研究結(jié)果表明，褪黑素能夠提高小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力，上調(diào)抑凋亡基因BCL-2mRNA 和蛋白表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因BAXmRNA 和蛋白表達(dá)，抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，但其抗凋亡機(jī)理尚不明確，還需要進(jìn)一步研究。