紫花地丁-白頭翁配伍對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用

薛觀宏，羅 燕，梁小瑞，裴文剛，馬 靜，熊科文，邵永斌

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

潰瘍性結(jié)腸炎即非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種常見的慢性炎癥性腸道疾病，主要累及結(jié)腸黏膜和結(jié)腸黏膜下層，呈連續(xù)性非節(jié)段性分布，臨床上多表現(xiàn)為腹瀉腹痛、黏液膿血便或便秘等癥狀，經(jīng)常性發(fā)作，纏綿難退，給患者帶來(lái)很大痛苦。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在臨床上除了手術(shù)以外，還未發(fā)現(xiàn)有效且方便的治療方法。

紫花地丁和白頭翁同屬清熱藥。紫花地丁具有抑菌、抗炎、抗內(nèi)毒素等功效。葉春芝[1]采用紫花地丁外敷內(nèi)服相結(jié)合治療蜂窩組織炎35 例，有效率為100%。趙麗娟[2]采用紫花地丁治療扁桃體炎。莊淑萍[3]將紫花地丁及蒲公英搗爛外敷治療腮腺炎。白頭翁具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原蟲、抑制病原體、增強(qiáng)免疫功能等功效。陳旭東等[4]采用白頭翁湯合槐花散治療20 例家畜血痢，治愈率達(dá)100%。王永剛[5]采用白頭翁湯治療濕熱蘊(yùn)結(jié)證，患者癥狀基本消失，臨床痊愈。閆港[6]配制中藥散劑加味馬齒莧白頭翁散，治療30 例仔豬白痢疾病，治愈率達(dá)91%。劉巖等[7]采用清熱解毒法，在五味消毒飲的基礎(chǔ)上加減治療仔豬病毒性心肌炎，治愈率為90%。由紫花地丁、黃芩、乳香等五味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱宣肺、化痰止咳等功效，效果顯著。周押琴等[8]研究證實(shí)，白頭翁加味湯對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎效果優(yōu)于柳氮磺胺吡啶腸溶片。然而，紫花地丁與白頭翁配伍在治療消化系統(tǒng)性疾病方面的研究較少。本試驗(yàn)旨在探究紫花地丁與白頭翁配伍對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用及其作用機(jī)制，為今后進(jìn)一步研究潰瘍性結(jié)腸炎的中藥治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 從石河子市子午路大藥房購(gòu)買紫花地丁和白頭翁，干燥至恒重。紫花地丁水煎劑：取紫花地丁200 g，用10 倍體積水浸泡30 min，加熱煮沸后微沸30 min，趁熱濾取藥液；在藥渣內(nèi)繼續(xù)加入8 倍量的水，煮沸后微沸30 min，濾取藥液，合并2 次藥液加熱濃縮至400 mL。白頭翁水煎劑：取白頭翁200 g，藥液制備過程同紫花地丁水煎劑，濃縮藥液至400 mL。紫花地丁-白頭翁配伍水煎劑：分別按1:1（紫花地丁100 g，白頭翁100 g）、1:3（紫花地丁50 g，白頭翁150 g）、3:1（紫花地丁150 g，白頭翁50g）的比例稱取藥材，同前述方法制備藥液并濃縮至400 mL。將所有制備完成的藥液裝于藥液瓶?jī)?nèi)，-4℃低溫保存?zhèn)溆谩Ｆ渌噭┌前愤拎つc溶片和右旋葡聚糖硫酸鈉。

試驗(yàn)儀器包括恒溫水浴鍋（型號(hào)：HHW21.600AII，天津市泰斯特儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Mu Itifuge XLR，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；微量移液器（型號(hào)：Transferpette-s，TBRAND 德國(guó)普蘭德）；精密電子天平（型號(hào)：BS423S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)）；自動(dòng)制冰機(jī)（型號(hào)：IM-50，常熟市雪科電器有限公司）。BX41TF 光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS；病理切片機(jī)：Leica RM2245；包理機(jī)：GE 1160；攤片機(jī)：Leica HI1220。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康昆明小鼠80 只，6～8 周齡，體重18～22 g，雌雄各半。小鼠購(gòu)入后飼養(yǎng)于（22±2）℃的動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開展試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 造模 將適應(yīng)性喂養(yǎng)后的80 只小鼠隨機(jī)分成8 組，每組10 只，除空白對(duì)照組外，其余各組每天分別于10:00、14:00 和16:00 給予3%右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液定量灌胃，每次0.6 mL/20 g 體質(zhì)量，連續(xù)7 d，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，空白對(duì)照組灌服蒸餾水。造模期間每天觀察小鼠飲食、毛發(fā)、一般活動(dòng)狀態(tài)等，出現(xiàn)稀便、腹瀉、大便隱血或肉眼血便的任一癥狀即判定為模型建立成功，選取造模成功的小鼠平均分入各試驗(yàn)組。

1.3.2 分組及給藥 試驗(yàn)共分為8 組，即空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、紫花地丁組、白頭翁組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組、紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（3:1）組。按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》中動(dòng)物給藥量計(jì)算：小鼠一日劑量=9.01×人的劑量（mg/kg）；人標(biāo)準(zhǔn)體重按60 kg 算，常規(guī)中草藥成人一日劑量按80 g計(jì)算，則小鼠一日用量為12 013 mg/kg，按上述方法計(jì)算出小鼠的一日劑量為240.26 mg（小鼠的標(biāo)準(zhǔn)體重按20 g 計(jì)算），將各中藥水煎成濃度約為0.48 g/mL 的湯劑；同法，給予小鼠一日所需柳氮磺胺吡啶腸溶片的等效劑量為450.5 mg/kg，經(jīng)研磨、溶解，配制成0.018 g/mL混懸液；空白對(duì)照組和模型組每日灌胃蒸餾水0.5 mL，陽(yáng)性對(duì)照組每日灌胃柳氮磺胺吡啶腸溶片混懸液0.5 mL，各水煎劑每日灌胃0.5 mL，連續(xù)7 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 一般情況觀察及疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分 分別于給藥第1、3、5、7 天稱小鼠體重，并取各小鼠糞便，觀察大便性狀，糞便隱血試劑盒（鄰甲苯胺法）測(cè)定大便隱血分?jǐn)?shù)。根據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠DAI 進(jìn)行評(píng)分，DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+大便隱血分?jǐn)?shù)）/3，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[9]。

表1 DAI 評(píng)分

1.4.2 結(jié)腸大體損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分 末次給藥2 h后，斷頸處死所有小鼠，剖開腹腔，取肛門至回盲部的結(jié)腸腸段，沿腸系膜緣縱行剖開，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干多余水分并放置于白板上，放大鏡觀察各小鼠結(jié)腸的形態(tài)及大體損傷程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[10]。

表2 結(jié)腸大體損傷指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)（CHPI）評(píng)分 每只小鼠在距離肛門1 cm 處取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變，組織學(xué)損傷程度用炎癥、病變深度、隱窩破壞與病變范圍評(píng)分的乘積表示。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3[11]。

1.4.4 結(jié)腸髓過氧化物酶（MPO）活性的測(cè)定 取2 cm結(jié)腸中下段，加9 倍結(jié)腸質(zhì)量的生理鹽水，充分勻漿，于4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清液，按照MPO 測(cè)試盒說明書，加入相應(yīng)的試劑，進(jìn)行MPO 活力測(cè)定。酶活力單位定義：每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中過氧化氫被分解為1 μmol 為1 個(gè)酶活力單位。MPO 活力=測(cè)定OD 值-對(duì)照OD 值/11.3×取樣量（g）。

表3 病理組織學(xué)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀 造模第5～6 天后，造模小鼠出現(xiàn)腹瀉，食欲下降，被毛雜亂等癥狀；造模第6～7 天，造模小鼠出現(xiàn)不同程度肉眼可見的稀便，活動(dòng)量明顯減少，處于安靜狀態(tài)。對(duì)造模組死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸有肉眼可見的潰瘍，造模成功。此時(shí)給小鼠分別給予不同比例配伍的紫花地丁與白頭翁水煎劑進(jìn)行干預(yù)，第1 天，癥狀恢復(fù)不明顯，個(gè)別小鼠仍有軟便，隨后每天體重均有所增加，個(gè)別增加不明顯，7 d 后，小鼠腹瀉、稀便等癥狀明顯減輕。

2.2 小鼠結(jié)腸組織學(xué)改變 由圖1 可見，空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體明顯，未見萎縮、壞死、變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠具有典型的潰瘍性結(jié)腸炎病理變化。結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)潰瘍，腺樣異常，不典型增生，并伴有淋巴細(xì)胞增生，嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩數(shù)量明顯減少。與模型組相比，紫花地丁-白頭翁（3:1）組，紫花地丁-白頭翁(1:3）組和紫花地丁-白頭翁（1:1）組隱窩數(shù)量均有所恢復(fù)，其中紫花地丁-白頭翁（3:1）組隱窩數(shù)量較其他組恢復(fù)明顯，隱窩炎癥減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度輕。

2.3 各組小鼠一般情況觀察及DAI、CMDI 以及CHPI評(píng)分結(jié)果由表2 可見，DAI 評(píng)分中，與空白對(duì)照組相比，紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組、白頭翁組、紫花地丁組以及模型組差異顯著，模型組差異極顯著；試驗(yàn)組間，紫花地丁-白頭翁（3:1）組與紫花地丁-白頭翁（1:3）組、紫花地丁-白頭翁（1:1）組以及紫花地丁組、白頭翁組差異顯著，紫花地丁-白頭翁（3:1）組和模型組之間差異極顯著。

圖1 小鼠結(jié)腸病理組織切片（HE 染色，40×10）

CMDI 評(píng)分中，與空白對(duì)照組相比，模型組差異顯著；試驗(yàn)組間，紫花地丁-白頭翁（3:1）組和模型組之間差異顯著，其余各組間差異不顯著。CHPI 評(píng)分中，與空白對(duì)照組相比，紫花地丁-白頭翁（1:1）組和模型組差異顯著；紫花地丁-白頭翁（3:1）組、紫花地丁-白頭翁（1:3）組和模型組之間差異顯著。

表2 小鼠DAI、CMDI 以及CHPI 評(píng)分結(jié)果

2.4 紫花地丁-白頭翁配伍對(duì)小鼠MPO 活性的影響表3 結(jié)果顯示，未給予任何藥物治療的模型組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性含量顯著升高，與空白對(duì)照組相比差異極顯著。給予各比例的紫花地丁與白頭翁配伍的水煎劑后，各組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性均有所降低，其中紫花地丁-白頭翁（3:1）組小鼠結(jié)腸組織的MPO 活性與模型組差異極顯著。

表3 結(jié)腸MPO 活性測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 紫花地丁與白頭翁的有效成分及作用 紫花地丁的有效成分為軟脂酸、對(duì)羥基苯甲酸、反式對(duì)羥基桂皮酸、丁二酸、二十四酰對(duì)羥基苯乙胺等，具有抗菌抗炎、抗內(nèi)毒素、抗氧化等藥理作用[12]。白頭翁的有效成分為羽扇豆烷型皂苷和齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷[13]，具有抗菌、抗炎、抗阿米巴原蟲、抑制病原體、增強(qiáng)免疫功能等功效。實(shí)驗(yàn)室前期通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)進(jìn)行了紫花地丁化學(xué)成分及其抗炎活性研究，結(jié)果顯示，紫花地丁提取物具有顯著的抗炎活性（未發(fā)表），為了研究紫花地丁在臨床上的應(yīng)用，采用復(fù)方形式與白頭翁配伍，治療臨床上潰瘍性結(jié)腸炎。

3.2 造模 DSS 誘導(dǎo)動(dòng)物結(jié)腸炎是潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型，常用于結(jié)腸炎藥理作用的研究，DSS 可破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致黏膜組織壞死，促進(jìn)DSS 在通透性增加的結(jié)腸組織中擴(kuò)散，從而加重炎癥反應(yīng)。該模型的建立簡(jiǎn)單方便，重現(xiàn)性好，便于實(shí)驗(yàn)的研究與篩選[14]。本試驗(yàn)以灌胃方式給予小鼠DSS 造模，造模第5～6 天后，造模小鼠出現(xiàn)腹瀉，食欲下降，被毛雜亂等癥狀；造模第6～7 天，造模小鼠出現(xiàn)不同程度肉眼可見的稀便，活動(dòng)量明顯減少，精神沉郁，處于安靜狀態(tài)。

3.3 紫花地丁-白頭翁配伍對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用 潰瘍性結(jié)腸炎以腹痛腹瀉，粘液狀血便為主要臨床癥狀，DSS 誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，大便稀軟，體重下降。本實(shí)驗(yàn)中，給予紫花地丁與白頭翁配伍的水煎劑，可緩解潰瘍性結(jié)腸炎小鼠糞便隱血程度以及疾病活動(dòng)指數(shù)，紫花地丁-白頭翁(3:1) 可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血便程度及精神狀況。通過組織病理學(xué)檢查，紫花地丁-白頭翁（3:1）明顯減少結(jié)腸組織損傷范圍，減輕炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，隱窩數(shù)量恢復(fù)明顯。紫花地丁-白頭翁（3:1）組與模型組的CHPI、CMDI 評(píng)分差異顯著，表明紫花地丁-白頭翁（3:1）可明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床表現(xiàn)。

在炎性反應(yīng)初期常伴發(fā)浸潤(rùn)程度和炎性因子水平的升高，MPO 是中性粒細(xì)胞中含量較高的一種酶，該活性可反映出中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目和活性，因此，常通過測(cè)量MPO 活性作為對(duì)損傷部位炎癥程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型組小鼠MPO 活性明顯升高，顯示炎區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，給予紫花地丁-白頭翁（3:1）水煎劑干預(yù)后，小鼠結(jié)腸MPO 活性顯著降低，表明該配伍比例可明顯減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎炎癥浸潤(rùn)程度及損傷程度。

綜上，紫花地丁-白頭翁（3:1）可減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，其機(jī)制可能與其抑制結(jié)腸中MPO活性有關(guān)。關(guān)于紫花地丁和白頭翁配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。