牦牛GPX5基因CDS區(qū)的克隆和表達(dá)研究

朱江江，袁 夢(mèng)，李鵬程，趙旺生*

（1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 6210101）

附睪作為哺乳動(dòng)物中精子成熟和儲(chǔ)存的場(chǎng)所，在生殖過程中不可或缺。附睪上皮所形成的管腔環(huán)境和附睪管使精子在附睪運(yùn)輸過程中逐漸獲得受精能力，在運(yùn)輸過程中精子質(zhì)膜發(fā)生許多改變。附睪中適量的活性氧（ROS）水平是正常精子生理成熟和能力發(fā)育的關(guān)鍵。附睪管ROS 過多可引起氧化應(yīng)激，破壞精子DNA 和大分子結(jié)構(gòu)[1]。但精子本身的細(xì)胞質(zhì)抗氧化劑水平較低，因此附睪中的抗氧化劑清除劑對(duì)精子有很好的保護(hù)作用，包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）[2]。

GPX5 是哺乳動(dòng)物GPX 家族中一個(gè)與眾不同的成員，與其他成員相比，GPX5 活性位點(diǎn)不含硒半胱氨酸（SeCys），而是半胱氨酸殘基[3]，因此又被稱為無(wú)關(guān)硒（Se）的GPX。GPX5 由附睪分泌，同GPX3 的含量超過總GPXs 的95%，存在于附睪液中[4]。GPX5基因?qū)π坌陨秤葹橹匾?。通過敲除GPX5基因的雄性小鼠模型研究顯示，廢除GPX5表達(dá)不僅導(dǎo)致附睪尾精子DNA 凝集降低，而且與之交配的雌鼠流產(chǎn)率以及幼鼠死亡率升高[5]。GPX5 能同精子質(zhì)膜相結(jié)合，保護(hù)精子在附睪運(yùn)輸和尾腔儲(chǔ)存過程中免受過氧化物的不利影響[6]。以上表明GPX5 在精子的抗氧化應(yīng)激上有著重要作用。

GPXs 家族主要是以谷胱甘肽（GSH）為還原劑，催化H2O2形成水或?qū)⒂袡C(jī)過氧化物進(jìn)行相應(yīng)的醇還原。GPX5同樣具備該能力，從上皮細(xì)胞被釋放到附睪腔后，它與精子頭部結(jié)合，以GSH 作為底物對(duì)附睪中的過氧化氫和磷脂氫過氧化物進(jìn)行催化，將附睪環(huán)境中ROS維持在一定濃度，減弱氧化應(yīng)激影響[7]。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致生物分子的損傷和細(xì)胞功能的嚴(yán)重障礙。脂質(zhì)過氧化尤其有害，其導(dǎo)致自由基擴(kuò)增，損傷膜的完整性和功能，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是DNA 損傷的主要原因[8]。精子對(duì)附睪中ROS 水平尤為敏感，精子的細(xì)胞膜含有大量能被過氧化物損傷的多不飽和脂肪酸[9]。GPX5的存在極大程度減弱了氧化應(yīng)激對(duì)精子的傷害[10]。

目前，有關(guān)GPX5基因在牦牛附睪中表達(dá)的未見詳細(xì)研究。本研究利用克隆手段得到牦牛GPX5基因的CDS 區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和熒光定量檢測(cè)其在附睪組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 從四川阿壩紅原采集3 頭年齡相近、體格相似、身體健康的公牦牛的睪丸。Hanks 溶液漂洗3 次，將附睪從睪丸中分割出來(lái)。把附睪分為附睪頭、附睪頸和附睪尾3 部分，置于凍存管中，迅速放入液氮中以備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取總 RNA 和合成cDNA 第1 鏈利用Trizol 試劑分別提取附睪的頭、頸和尾的總RNA，依靠QUAWELL超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。以生工生物工程（上海）股份有限公司合成的M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟為操作依據(jù)，把總RNA 做模板，將cDNA 第1 鏈合成后置于冰箱-20℃中。

1.2.2 設(shè)計(jì)引物及克隆 以軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)牦牛GPX5的PCR 克隆的引物，GPX5-F：5'-ATGACTA TACAGTTAAGGGC-3'，GPX5-R：5'-TTATTTGGTTTT GAACTG-3'，以牦牛附睪組織反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，20 μL 體系：DNA 聚合酶mix（2×）10 μL，7.0 μL ddH2O，混合的上、下引物2.0 μL（10 μmol/L），再分別加入附睪不同部分組織的cDNA 1.0 μL（100 ng）。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s；共循環(huán)40 次，后經(jīng)72℃進(jìn)行2 min 的延伸。將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行DNA 的純化并與目的片段和載體連接、進(jìn)行轉(zhuǎn)化及鑒定后，送于成都擎科梓熙生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)牦牛GPX5基因所編碼的蛋白特性并分析其功能。利用軟件BioXM 2.6 分析牦牛GPX5的核苷酸和氨基酸序列。利用在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析GPX5 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，登錄NCBI 的BLAST 比對(duì)氨基酸同源性，選擇 MEGA6.0 對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行構(gòu)建。其他相關(guān)生物學(xué)的預(yù)測(cè)方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.4 熒光定量qPCR 軟件Primer Premier 5.0 對(duì)基因GPX5及內(nèi)參基因β-ACTIN的特異性的定量引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。GPX5-F：5'-ATGACTATACAGTTAAGGGC-3'和GPX5-R：5'-TTATTTGGTTTTGAACTG-3'；β-ACTIN-F：5'-AAGTTCTACAGTGTGGCCGA-3' 和β-ACTIN-R：5'-GACTGGCCCCTTCTCCTTAG-3'。熒光定量操作方法以生工的2XSG Fast qPCR Master Mix 試劑盒的說(shuō)明書為標(biāo)準(zhǔn)。10 μL 體系：2xSG Fast qPCR Master Mix 5 μL，取混勻的上、下游引物0.8 μL，PCR-grade water 3.1 μL，模板DNA 為0.5μL，以每樣3 個(gè)重復(fù)為對(duì)照。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min，95℃2 s，60℃25 s；40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 牦牛附睪GPX5基因克隆產(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示，GPX5基因DNA 有730 bp。CDS 區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，GPX5基因長(zhǎng)度為630 bp，共編碼了氨基酸209，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA（圖1）。

圖1 牦牛GPX5 氨基酸排列圖

2.2 GPX5 蛋白理化性質(zhì) EXPASY 分析表明，牦牛GPX5氨基酸分子式為C1105H1672N278O300S10，分子量為23.97 ku，總氨基酸數(shù)為209，占比最高的為亮氨酸，達(dá) 9.1%，其次為苯丙氨酸（8.6%）和谷氨酸（8.1%），色氨酸含量最低（1.4%）。其負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）和正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）分別是20 和23，等電點(diǎn)為8.51，親水系數(shù)（GRAVY）為-0.237，脂肪系數(shù)值是76.41，不穩(wěn)定的系數(shù)是42.70，該蛋白不穩(wěn)定。

2.3GPX5的同源性GPX5在BLAST 上同其他物種進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊（XM_005696698.2）、綿羊（NM_001267883.1）、家 豬（NM_213886.1）、家 貓（XM_023254695.1)、倉(cāng)鼠（NM_001256840.1）的同源性分別是95%、95%、90%、87%、86%。用MEGA6.0 將 以上物種的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖2），可知牦牛與山羊和綿羊的親緣比較接近，這符合物種進(jìn)化規(guī)律。

圖2 GPX5 的進(jìn)化樹

2.4 牦牛GPX5基因的結(jié)構(gòu) 利用NeTPhos 3.1 Server進(jìn)行預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)的結(jié)果（圖3）顯示，絲氨酸有5個(gè)，酪氨酸有3 個(gè)，蘇氨酸有6 個(gè)。由SOPMA 軟件分析GPX5 的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖4）顯示，GPX5 蛋白有73 個(gè)氨基酸在α螺旋區(qū)，為34.93%（73/209）；氨基酸有44 個(gè)在延伸鏈結(jié)構(gòu)，為 18.18%（38/209）；21 個(gè)在β轉(zhuǎn)角區(qū)，為8.13%（38/209）；無(wú)規(guī)則狀態(tài)下的有81 個(gè)，為38.76%（81/209）。利用ProtScale 分析其親疏水性（圖5），最大值2.711 在第15 個(gè)位點(diǎn)處，最小值-2.644 在108 個(gè)位置上，GPX5 整體為親水性，這與其理化性質(zhì)預(yù)測(cè)相符。利用TMHMM 2.0 分析GPX5 蛋白的跨膜區(qū)（圖6），可知GPX5 蛋白無(wú)跨膜的結(jié)構(gòu)域。采用軟件SignalP 4.1 Server 預(yù)測(cè)GPX5 信號(hào)肽（圖7），最高值在22 位處，C 為剪切點(diǎn)分值 0.547，Y 為結(jié)合剪切點(diǎn)值 0.702，S 是信號(hào)肽值最高為0.964。由圖7 可知，該蛋白存在信號(hào)肽，即為分泌蛋白。

圖3 GPX5 蛋白的磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)圖

圖4 牦牛GPX5 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

圖5 牦牛GPX5 親疏水預(yù)測(cè)圖

圖6 牦牛GPX5 結(jié)構(gòu)域圖

圖7 預(yù)測(cè)牦牛GPX5 信號(hào)肽

2.5 牦牛附睪各組織的分析表達(dá) 附睪頭、附睪頸、附睪尾的cDNA 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增并利用軟件SigmaPlot 11.0 整理發(fā)現(xiàn)，GPX5在附睪頭高水平表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于附睪頸和附睪尾（圖8）。

圖8 牦牛附睪GPX5 的表達(dá)

3 討 論

GPX5首次從小鼠附睪中被發(fā)現(xiàn)[12]，在附睪中的表達(dá)同附睪特異性轉(zhuǎn)錄因子、睪丸因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等有關(guān)，還受雄激素的控制[4]。盡管GPX5作為無(wú)硒的GPX，但已有研究證實(shí)，其與GPXs 其他家族成員一樣具有催化活性[13]，并作為磷脂過氧化氫酶在抗氧化防御中發(fā)揮重要的生理作用[14]。在缺硒的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，GPX5mRNA 表達(dá)水平的增加可彌補(bǔ)GPX下降的活性，亦可間接證明GPX5的功能[15]。同時(shí)，精液中GPX5含量也與精子質(zhì)量有關(guān)。Barranco 等[16]在豬精液研究中發(fā)現(xiàn)，低精子質(zhì)量組的GPX5含量高于高精子質(zhì)量組。由此推測(cè)低質(zhì)量精子更容易受到氧化損傷，而高水平的GPX5可以彌補(bǔ)這種高敏感性。此外，精液中GPX5含量同精子膜的完整性及運(yùn)動(dòng)參數(shù)呈負(fù)相關(guān)[16]。這都說(shuō)明GPX5與雄性哺乳動(dòng)物的生殖能力密切相關(guān)。本研究克隆獲得牦牛GPX5序列長(zhǎng)730 bp，CDS 區(qū)有630 bp，編碼氨基酸為209 個(gè)。GPX5的親緣距離是從偶蹄目到食肉目和嚙齒目。進(jìn)化樹演變同動(dòng)物分類學(xué)規(guī)律演變一致。因其負(fù)電值比正電值小，即蛋白質(zhì)帶正電；且GRAVY 為負(fù)值，因此牦牛GPX5編碼的是帶正電的不穩(wěn)定親水蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白的磷酸化位點(diǎn)共有14 個(gè)，為研究其磷酸化指明方向，同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則為主，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行延伸。TMHMM 2.0 預(yù)測(cè)其跨膜域時(shí)，未發(fā)現(xiàn)存在跨膜區(qū)域，但用SignalP 4.1 發(fā)現(xiàn)該蛋白有信號(hào)肽的存在，即存在于細(xì)胞器基質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的分泌蛋白。熒光定量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，GPX5在牦牛附睪頭中高表達(dá)，這與小尾寒羊[17]附睪的研究相符，在羊整個(gè)附睪中均檢測(cè)到GPX5，但附睪頭組織中GPX5水平明顯高于體和尾。在牛附睪頭中亦高水平表達(dá)[18]。Rejrari 等[19]發(fā)現(xiàn)，附睪中的GPX5有3 種存在方式，分別為可溶性附睪液蛋白，精子質(zhì)膜結(jié)合蛋白，結(jié)合脂質(zhì)并對(duì)其催化蛋白，他們都具有保護(hù)精子的作用；而在附睪尾，GPX5大多與精子結(jié)合，游離的較少?？傊珿PX5對(duì)精子的保護(hù)作用不容忽視，其能避免氧化應(yīng)激對(duì)精子的刺激，有利精子DNA 完整性的保持，保證精子質(zhì)量和提高受精率。以上研究說(shuō)明，GPX5在附睪中具有重要意義，在附睪頭中的表達(dá)量最高，其蛋白可通過附睪上皮細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，分泌到附睪腔內(nèi)，以彌補(bǔ)未成熟精子的先天性抗氧化酶的缺乏[20]。同時(shí)，GPX5除具有抗氧化作用外，GPX5亦能對(duì)精子活力和頂體反應(yīng)產(chǎn)生影響。Barranco 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與低濃度的GPX5 相比，高濃度的GPX5 豬精漿可延緩精子活力下降率，人工授精后的分娩率及產(chǎn)仔率較高，表明精子活力和繁殖力與在精漿中的GPX5含量呈正相關(guān)。有研究表明，GPX5能同附睪精子頂體區(qū)的脂質(zhì)過氧化物相結(jié)合，從而防止脂質(zhì)過氧化物和磷脂酶相互作用引起的頂體反應(yīng)[21]。綜上，GPX5在附睪中有保護(hù)精子避免進(jìn)行早熟頂體反應(yīng)及對(duì)精子受精能力的維持作用，且研究哺乳動(dòng)物附睪中的GPX5對(duì)探索雄性生殖生理的機(jī)理具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆牦牛GPX5基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GPX5蛋白為不穩(wěn)定的，帶正電具有親水性，且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域但卻是分泌性的蛋白；經(jīng)過qPCR 技術(shù)檢測(cè)，GPX5在牦牛附睪組織表達(dá)分布不均，附睪頭的表達(dá)明顯高于附睪頸和附睪尾。本研究初步對(duì)牦牛的GPX5進(jìn)行了探索，為后續(xù)繼續(xù)研究牦牛GPX5的功能奠定基礎(chǔ)。