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    人脂肪干細胞源外泌體對HaCaT細胞損傷修復(fù)及遷移功能影響的初步實驗研究

    2019-10-17 00:39:48張遠遠曾悅朱艷霞廉翠紅
    中華皮膚科雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:實驗

    張遠遠 曾悅 朱艷霞 廉翠紅

    1深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院皮膚科 518035;2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系 518000

    臨床上,各種炎癥、潰瘍、燒傷等造成皮膚的損傷修復(fù)是亟需解決的問題[1]。研究表明,脂肪組織來源的干細胞促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的一個重要作用途徑是旁分泌,旁分泌的載體外泌體可能是促進創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵因素[2]。與直接使用干細胞相比,富集了來源細胞的蛋白質(zhì)、mRNA 和 miRNA[3-4]等信號分子的外泌體具有生物相容性、低毒性、低免疫原性等安全性特性[5-6]。相對于其他干細胞來源,人脂肪干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSC)來源容易且體外擴增速度快[7],外泌體獲得更為容易,因此hADSC 的外泌體更適合運用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。為了探索一種基于hADSC 外泌體的無細胞療法,我們結(jié)合超速離心和超濾濃縮提取大樣本的外泌體,并在人角質(zhì)形成細胞上進行功能學(xué)驗證,為后續(xù)hADSC 外泌體的無細胞創(chuàng)面治療機制研究提供依據(jù)。

    材料與方法

    一、材料

    1.主要試劑:0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均產(chǎn)自美國Gibco 公司;鼠抗人 CD63、Alix、TSG101 單克隆抗體來自英國abcam 公司;無外泌體培養(yǎng)基血清來自以色列Vivacell公司;BCA試劑盒來自南京碧云天公司。

    2.主要儀器:Optima MAX-XP臺式超速離心機(美國Beckman Coulter 公司)、100 000 超濾管(美國Millipore 公司,UFC910096-1pk)、納米激光粒徑分析儀(DLS,美國Beckman公司,DelsaMax CORE)。

    二、實驗方法

    1.分離培養(yǎng)原代 hADSC[8]:本研究已通過深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準,批件號KS20181229001,取材前受試者已簽署知情同意書。無菌條件下獲得1 例35 歲女性志愿者抽脂術(shù)后脂肪組織20 ml,將勻漿狀脂肪移入50 ml離心管中,按照1∶2 體積加入0.25%胰蛋白酶(無乙二胺四乙酸)和0.1%Ⅰ型膠原酶消化液。37 ℃恒溫搖床振蕩消化5 min,移液管吹打消化10 min,靜置待液面分層,將下層液體移入離心管中,用2 倍體積的完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+高糖DMEM+1%青霉素/鏈霉素)終止消化。在剩余脂肪中加入新的消化酶混合液,重復(fù)以上步驟3 次,每次消化時間應(yīng)<30 min。將收集到的液體1 500 r/min 離心15 min(最大離心半徑8.68 cm),去上清液,向細胞沉淀中加入完全培養(yǎng)基重懸細胞,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后觀察換液,棄去未貼壁細胞,每3 天換液1 次。當細胞生長至融合度90%時,用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

    2.外泌體分離:根據(jù) Thery 等[9]所制定的外泌體提取方法中,超速離心法與超濾法結(jié)合改良。取70%~80%融合的第4 ~6代脂肪干細胞,用無外泌體血清配制的培養(yǎng)基處理48 h,收集150 ml 上清液。按照圖1流程進行差速離心,用1 ml長槍頭棄去上清液(外泌體沉淀過小,不易看到,可在管壁作標記,以防誤吸丟失),然后用1 × 磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸外泌體,收集后-80 ℃保存。

    3.外泌體鑒定:采用透射電鏡觀察濃縮后的外泌體、拍照,DLS 檢測粒徑大小,收集數(shù)據(jù)。Western 印跡法檢測外泌體抗原表達,用蛋白裂解液裂解外泌體提取蛋白,加入蛋白樣品常規(guī)10%分離膠電泳轉(zhuǎn)膜后,把硝酸纖維素膜用5%脫脂牛奶在 TBST 緩沖液中封閉 1 h,TBST 洗膜 3 次,每次7 min。鼠抗人 CD63、Alix 和 TSG101 單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后,TBST 洗膜3 次,每次7 min。辣根過氧化物酶標記的特異性兔抗鼠二抗(1∶5 000)孵育1 h 后,TBST 洗膜,配制顯影液,凝膠成像系統(tǒng)下顯影曝光。按照說明書用BCA 法檢測外泌體蛋白濃度。

    4.H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建表皮細胞損傷模型:取對數(shù)生長期HaCaT 細胞重懸計數(shù),按照5×103個/孔接種于96孔板,孵育12 h。取上清液,加入100 μl終濃度為0、50、100、200、250、300、400、500、600、800 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液,每組設(shè)6個復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中作用1 h后,去除刺激培養(yǎng)基,PBS清洗1遍,加入培養(yǎng)基(110 μl/孔)與CCK8 預(yù)混液,孵育3 h,酶標儀檢測各孔450 nm波長處吸光度(A450值)。

    5.外泌體攝取實驗:將HaCaT細胞(1×104個)懸液接種于共聚焦小皿中培養(yǎng)24 h后,細胞貼壁生長,當融合率為20%~30%時將HaCaT細胞分為正常組(PBS預(yù)處理)和損傷組(用100 μmol/L H2O2預(yù)處理30 min),預(yù)處理結(jié)束后損傷組撤去H2O2,將兩組再均分為兩個亞組,即治療組和對照組,其中治療組與外泌體共培養(yǎng),對照組與PBS共培養(yǎng)。共培養(yǎng)前,按照親脂熒光染料PKH26 說明書對外泌體避光染色5 min,取染色后的外泌體(5 mg/L)與HaCaT 細胞共培養(yǎng)2 h,棄培養(yǎng)上清液,用PBS沖洗2遍,于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

    6.外泌體對HaCaT細胞遷移力的影響:

    (1)劃痕實驗:按照“外泌體攝取實驗”中方法對細胞分組處理,共培養(yǎng)2 h 后,取對數(shù)生長期HaCaT 細胞,消化、離心、計數(shù),以5 × 104個/孔接種于 24 孔板,12 h 鋪滿后用 200 μl 槍頭垂直孔板劃痕,用PBS 輕輕沖洗細胞1 次,對照組和治療組分別加入2 ml 10%血清低糖培養(yǎng)基、10%血清低糖培養(yǎng)基 + 10 mg/L 外泌體(hADSC 外泌體),放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0、12、24 h時拍照記錄,通過Image J軟件計算細胞遷移面積,分析兩組劃痕修復(fù)率。

    (2)Transwell 遷移實驗:取對數(shù)生長期HaCaT細胞用PKH26 染色后重懸計數(shù),以5×104個/孔接種于上室,分為正常組和損傷組,處理同上。撤去H2O2后,將正常組和損傷組分為治療組和對照組,治療組下室加入含10 mg/L 外泌體的完全培養(yǎng)基,而對照組下室則加入與外泌體等體積的PBS 完全培養(yǎng)基。分別置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定,熒光顯微鏡觀察遷移細胞數(shù)。隨機選取8個10倍鏡下視野,用圖像分析軟件NIS-Elements Viewer 4.20(日本Nikong 公司)計算每個視野下的平均細胞數(shù)。

    圖1 超速離心和超濾濃縮結(jié)合的改良外泌體分離流程圖 帶紅色瓶蓋者為超濾管,管中為超濾膜;帶黃色瓶蓋者為普通離心管

    圖2 人脂肪干細胞形態(tài)(×100) 2A:原代培養(yǎng)24 h;2B:原代培養(yǎng)3 d;2C:原代培養(yǎng)7 d,細胞達80%融合;2D:擴增至4代時脂肪干細胞已經(jīng)純化,以成纖維樣典型梭形為主

    7.統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD 檢驗,P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性檢驗采用Spearman 檢驗,P< 0.01 認為顯著相關(guān)。每組實驗至少重復(fù)3 次以校正P值和控制系統(tǒng)誤差。

    結(jié) 果

    一、hADSC的形態(tài)

    從人皮下脂肪組織中分離獲得的hADSC 具有較強的增殖和分化能力。接種24 h內(nèi)開始貼壁,原代hADSC初為短梭形,細胞大小不等,核質(zhì)比例較大(圖2A);3 d 后可見細胞伸展,大多數(shù)細胞為長梭形,形態(tài)類似成纖維細胞,核呈橢圓形,較大(圖2B);7 d時可達80%融合(圖2C);第4代hADSC已經(jīng)純化,以成纖維樣典型梭形為主,且排列緊密,大小一致,呈漩渦狀生長(圖2D)。

    二、hADSC外泌體的鑒定

    從hADSC 培養(yǎng)上清液中提取的外泌體,電鏡下具有外泌體典型的杯狀形態(tài),且大小均一(圖3)。利用DLS檢測顯示,樣品中外泌體直徑中位數(shù)(P25,P75)為195.59 nm(121.62 nm,248.03 nm),范圍75.62 ~ 641.52 nm,純度為65.88%。Western 印跡檢測(圖4)顯示,外泌體表達CD63、Alix、TSG101特異蛋白。BCA 法測定外泌體蛋白實際濃度為730.14 mg/L。

    圖3 透射電鏡下觀察從脂肪干細胞外泌體的形態(tài)特征 外泌體直徑略小于100 nm,具有茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)

    三、CCK8法構(gòu)建表皮細胞損傷模型

    如圖 5 所示,H2O2在 0 ~ 300 μmol/L 范圍內(nèi)有明顯抑制HaCaT 細胞增殖的作用,細胞存活率與H2O2濃度呈負相關(guān)(r=-0.91,P< 0.01),而H2O2濃度在300 μmol/L 以上時,大多數(shù)細胞凋亡。因此,確定后續(xù)實驗中H2O2濃度為100 ~ 200 μmol/L,作用時間為1 h。

    四、外泌體攝取實驗

    見圖6。共聚焦顯微鏡下觀察,共培養(yǎng)2 h后,正常組HaCaT 細胞形態(tài)正常,呈鋪路石樣排列,損傷組HaCaT 細胞存在凋亡表現(xiàn);正常治療組、損傷治療組兩組細胞胞質(zhì)內(nèi)散在分布紅色熒光顆粒,是染色后被HaCaT 細胞攝取的外泌體。正常治療組熒光亮度大于損傷治療組,說明損傷后HaCaT細胞攝取能力下降。

    圖4 Western 印跡檢測外泌體 Alix、CD63、TSG101 蛋白的表達 M:標準參照物;1 ~ 3:分別為Alix、CD63、TSG101蛋白

    圖5 不同濃度H2O2作用1 h后HaCaT細胞存活率 1 ~10:分別為0、50、100、200、250、300、400、500、600、800 μmol/L。0 ~ 300 μmol/L范圍內(nèi),H2O2濃度與HaCaT細胞存活率呈負相關(guān)

    圖6 HaCaT 細胞吞噬外泌體情況(×200) 紅色熒光顆粒示PKH26染色后外泌體。正常治療組的熒光亮度及數(shù)量大于損傷治療組,說明損傷的HaCaT 細胞攝取外泌體數(shù)量低于正常HaCaT細胞

    五、外泌體對HaCaT細胞遷移力的影響

    劃痕實驗(圖7)顯示,正常對照組、正常治療組、損傷對照組、損傷治療組HaCaT 細胞12 h 劃痕面積修復(fù)率分別是40.26% ± 0.64%、69.57% ±0.69%、32.28%±0.31%、69.62%±1.68%,損傷治療組顯著高于損傷對照組(t= 37.33,P< 0.01)。Transwell 實驗(圖8)顯示,正常對照組、正常治療組、損傷對照組、損傷治療組10倍視野下遷移細胞數(shù)量分別是20.85±4.84、44.8±5.24、14.95±2.58、40.05 ± 7.66,正常對照組和正常治療組間(t=17.30,P< 0.01)、損傷對照組和損傷治療組間(t=25.10,P<0.01)差異都有統(tǒng)計學(xué)意義,并且正常對照組遷移細胞數(shù)大于損傷對照組(t= 4.80,P<0.01),正常治療組與損傷治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.75,P> 0.05)

    討 論

    圖7 劃痕實驗檢測人脂肪干細胞外泌體對HaCaT細胞遷移的影響 損傷治療組的劃痕修復(fù)率較損傷對照組明顯減少

    圖8 Transwell實驗觀察外泌體對HaCaT細胞損傷刺激后24 h遷移能力的影響(×100) 熒光顯微鏡下,損傷治療組穿膜細胞計數(shù)高于損傷對照組

    現(xiàn)有外泌體分離方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、抗體磁珠結(jié)合法、沉淀法等[10-11]。國外研究顯示[12],單純的超速離心由于不同類型轉(zhuǎn)子和使用者之間的差異,回收率常常不同,且耗時,操作繁瑣[13]。通過改良,我們探索出適合 hADSC 外泌體的提取方法,即先用100 000 超濾管對低速差速離心后的離心液進行超濾濃縮,得到富含外泌體的超濾液,再超速離心把外泌體從這樣的濃縮液中分離沉淀下來。這樣獲得的外泌體重懸后立即進行分析[14],能更加準確地測量外泌體的表面特征、形態(tài)特征和蛋白質(zhì)含量。如果不能立即分析,為了保證外泌體蛋白含量和功能分析的準確性,可以將外泌體在4 ℃保存(約1周)或-80 ℃保存(1年)[15]。

    本研究提取外泌體的方法有如下優(yōu)點:①步驟簡單:無需其他輔助工具或者儀器,使其不僅克服了現(xiàn)有單純超速離心法步驟多帶來的操作失誤及混入雜質(zhì)的缺點,而且解決了現(xiàn)有單純超濾法數(shù)次濃縮后外泌體粘連在超濾膜上造成外泌體流失的問題;②雜蛋白少:如果采用過小孔徑的超濾管易導(dǎo)致濾孔堵塞,造成雜蛋白混入,本研究選擇更大的孔徑可以截留相對分子質(zhì)量100 000的超濾管濃縮上清液,即完全可以截留直徑40 ~200 nm 的納米囊泡結(jié)構(gòu)的外泌體,又能有效防止堵塞,減少雜蛋白;③高效性:對于現(xiàn)有單純的超速離心法,最大的超速離心管僅30 ml,一次4 h 只能處理240 ml,而濃縮后超速離心,一次能處理的細胞上清液是單純超速離心法的60倍;④價格低廉:超濾管和超速離心管均可以重復(fù)利用3 ~5次,分離方法簡單,成本低,且可節(jié)省人力和物力,更加適合外泌體產(chǎn)業(yè)化要求。

    通過上述改良方法所分離出的囊泡結(jié)構(gòu)具有典型的外泌體形態(tài)特征:電鏡下囊泡呈杯狀、扁平球形(直徑60 ~ 80 nm),DLS 顯示樣品外泌體純度達65.88%,并且表達CD63、Alix 和TSG101,與其他學(xué)者研究的結(jié)果一致[16-17]。綜上結(jié)果說明,提取的外泌體符合現(xiàn)有研究公認水平[18-20]。DLS和電鏡所測量的粒徑有差異,有研究顯示,采用直接冷凍,低溫電鏡觀察前列腺上皮細胞來源外泌體是含水飽滿的圓型,而不是杯狀[21],所以猜測可能因為電鏡樣品制作時化學(xué)固定導(dǎo)致外泌體極度脫水,使得電鏡粒徑較DLS 的結(jié)果偏小,推測杯狀結(jié)構(gòu)因此產(chǎn)生。外泌體屬于溶液狀態(tài)下的復(fù)合粒子,而DLS基于動態(tài)光散射原理測水合粒徑(流體動力學(xué)直徑)會比真實粒徑大,因為溶液中的外泌體外面還有一層膨脹的膠團[22-23]。同時如果顆粒團聚,動態(tài)光散射測出的是團聚后粒徑,也會影響平均粒徑,最后DLS 測得數(shù)據(jù)因計算方法不同,半徑結(jié)果也不同。所以DLS 測量的粒徑大小只是判斷外泌體的手段之一。外泌體的囊泡結(jié)構(gòu),對于其內(nèi)含有的大量不同種類的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分以及核酸是一種保護結(jié)構(gòu),能使外泌體在不同的酸堿環(huán)境、缺氧、高溫、反復(fù)凍融等惡劣條件下仍保持較高穩(wěn)定性。

    目前外泌體的定量尚不規(guī)范,常用BCA 蛋白測量法和納米顆粒分析追蹤儀這兩種方法,前者是通過檢測樣品總蛋白來間接測定外泌體含量,后者是檢測納米囊泡數(shù)量,但兩種方法其實都不能直接定量外泌體的量。本研究通過BCA 蛋白定量外泌體,150 ml左右的上清液可以收集73.14 μg左右蛋白,但也存在收集量不穩(wěn)定的情況。因為以干細胞外泌體為載體的無細胞療法,是利用其攜帶的分子(蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì))調(diào)控相關(guān)通路,間接或直接治療,這就迫切需要更精確的設(shè)備分析定量所提取外泌體的產(chǎn)率、純度以及內(nèi)容物。

    目前許多研究表明,外泌體具有類似干細胞的組織修復(fù)功能,可獨立地作為一種生物活性成分應(yīng)用于皮膚損傷修復(fù)治療,甚至替代干細胞發(fā)揮功能。當皮膚損傷時,脂肪干細胞被趨化至傷口附近,產(chǎn)生外泌體調(diào)控受損區(qū)域細胞自我修復(fù)與組織再生,加速創(chuàng)面修復(fù)。Oh 等[24]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細胞外泌體通過顯著抑制成纖維細胞(HDF)的衰老標志物SA-β-Gal 和基質(zhì)降解酶的過表達,促進HDF表達Ⅰ型膠原蛋白達到治療作用,從而證明多能干細胞外泌體抗皮膚衰老的潛力。Kim 等[25]研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細胞來源的多能干細胞的外泌體通過增加細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 的磷酸化,促進HaCaT 細胞和HDF 的生長和增殖,并觀察到外泌體治療組HaCaT 細胞的纖連蛋白水平更高。Bakhtyar 等[2]采用蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),人臍帶華氏膠組織(Wharton′s Jelly)來源的間充質(zhì)干細胞外泌體中高表達α2M 蛋白,推測此蛋白可能是外泌體促進創(chuàng)面修復(fù)的重要因子。Hu等[16]用小鼠皮膚切口模型體內(nèi)示蹤法證實,外泌體可以被成纖維細胞攝取,并以劑量依賴性方式刺激細胞遷移、增殖和膠原合成,增加神經(jīng)-鈣黏素、細胞核抗原、細胞周期蛋白D1和膠原Ⅰ、Ⅲ基因的表達,為傷口修復(fù)提供結(jié)構(gòu)支架作用的膠原蛋白,從而促進小鼠皮膚肉芽組織的形成。另有研究也證實,干細胞來源的外泌體能夠加速傷口愈合和減輕瘢痕形成,并且用HDF 在細胞水平上驗證外泌體促進其增殖和遷移[26-27],Zhang等[27]認為,臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體能促進HaCaT 細胞的增殖與遷移,并通過活化AKT 信號通路抑制熱損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡,而AKT 的活化不能完全解釋外泌體對皮膚細胞增殖和遷移的促進作用。因此,雖然干細胞源外泌體在皮膚損傷修復(fù)中有大量研究,但這些研究大多集中于HDF,脂肪來源干細胞的外泌體是否也能促進HaCaT細胞遷移尚不清楚,以及外泌體修復(fù)氧化應(yīng)激損傷后HaCaT細胞的效果也并未見報道。

    研究發(fā)現(xiàn),皮膚創(chuàng)傷時外源因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在皮膚損傷中起關(guān)鍵作用。而大量活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生是氧化應(yīng)激的最重要因素之一。而具有無電荷,相對穩(wěn)定的H2O2是ROS 主要成分之一[28]?;谏鲜銮闆r,本研究用100 μmol/L H2O2處理1 h 制備HaCaT 細胞輕中度損傷模型,以模擬皮膚創(chuàng)傷時生理狀態(tài),然后用10 mg/L hADSC 外泌體來治療。劃痕實驗說明,在創(chuàng)傷發(fā)生12 h內(nèi)損傷治療組的HaCaT 細胞較損傷對照組增殖和遷移速度更快[29],外泌體治療起效的時間點相同,這說明外泌體可能攜帶促進/阻斷細胞增殖信號表達的相關(guān)遺傳信息,使其作用12 h內(nèi)可以調(diào)節(jié)受體細胞的增殖水平,而后恢復(fù)正常水平。同時在外泌體攝取實驗中損傷治療組較正常治療組吞噬外泌體減少,推測主要原因是外泌體的選擇性:即處于不同狀態(tài)的HaCaT細胞選擇性地吞噬外泌體,對于正常脂肪干細胞在正常生長情況下分泌的外泌體,其內(nèi)容物不是損傷組HaCaT細胞需要的,所以只是少量吞噬,既往文獻曾報道過這種選擇性[30-31];也有可能是損傷治療組細胞膜在H2O2的作用下發(fā)生了功能損傷,無法完成流暢的攝取功能以及觀察時間過短難以力證損傷組HaCaT 細胞吞噬外泌體較正常HaCaT細胞攝取減少。這說明外泌體因為攜帶的內(nèi)容物不同而具有選擇性,這種選擇性在外泌體調(diào)控效應(yīng)細胞生理功能方面具有重要作用。Transwell 實驗說明,hADSC外泌體確實可以促進損傷組HaCaT細胞的遷移。在創(chuàng)傷愈合中,表皮細胞快速遷移覆蓋傷口,是抗感染和加速愈合的重要步驟[32]。根據(jù)本實驗結(jié)果,我們推測hADSC 來源的外泌體具有調(diào)節(jié)皮膚創(chuàng)傷愈合中細胞遷移的作用,可以加速創(chuàng)傷愈合與抑制瘢痕形成,提升創(chuàng)面修復(fù)能力,至于創(chuàng)傷愈合過程中外泌體與炎癥反應(yīng)、細胞增殖、分化、血管生成與基質(zhì)重建等多個階段[33]的關(guān)系還需更深一步研究。

    綜上所述,我們通過改良法從脂肪干細胞上清液中成功分離出外泌體,證實無論損傷組還是正常組HaCaT 細胞都能夠攝入PKH26 標記的外泌體,并用提取的外泌體進行功能實驗,初步說明hADSC外泌體具有促進氧化應(yīng)激損傷后HaCaT 細胞遷移的能力,為后續(xù)的機制研究提供了依據(jù)。另外,本研究由于時間和精力所限,還有很多不足,如劃痕實驗無法排除細胞生長增殖的影響,缺乏動物實驗,有待在今后研究中進一步補充、修正和深入。

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