c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的合成及其條件優(yōu)化

張 旭,葛 飛,朱龍寶,李婉珍,宋 平,陶玉貴

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

化學(xué)治療(化療)是臨床治療惡性腫瘤的主要方法之一[1]，但化療藥物的生物利用度低、選擇性差，藥物進(jìn)入體內(nèi)后，迅速分散到體內(nèi)的各組織、器官中，只有少部分化療藥物能夠隨機(jī)到達(dá)腫瘤部位，導(dǎo)致化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常組織、器官都會(huì)造成殺傷[2-3]。如何使化療藥物精確遞送至腫瘤部位成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。納米科學(xué)技術(shù)在材料合成、生物和藥學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為靶向遞送化療藥物提供了機(jī)遇[4]。其中納米載體由于具有靶向遞送、可控釋放、較低的生物毒性和更高的藥物生物利用度等特點(diǎn)，已經(jīng)成為化療藥物遞送的熱門(mén)研究領(lǐng)域[5-6]。

納米材料聚己內(nèi)酯(PCL)以其優(yōu)良的生物降解性及生物相容性，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用到藥物載體領(lǐng)域，并獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)[7]。聚己內(nèi)酯由幾內(nèi)酯開(kāi)環(huán)聚合得到，具有很好的柔韌性和可加工性，其熔點(diǎn)為59～64℃，這為其應(yīng)用于藥物可控釋放提供了依據(jù)。但表面具有疏水性的PCL在體內(nèi)容易被蛋白質(zhì)吸附和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別并捕獲，這導(dǎo)致其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間減少[8]。為了滿(mǎn)足聚己內(nèi)酯作為藥物載體的應(yīng)用需求，通常在其表面進(jìn)行親水性修飾。聚乙二醇(PEG)是一種生物相容性好、毒性低的水溶性聚合物[9]，PEG與PCL進(jìn)行共聚，形成PEG-PCL共聚物，有效地提高了其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。但PEG-PCL載體在體內(nèi)無(wú)法主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，僅僅依靠高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)無(wú)法在腫瘤部位大量積累，使得治療效果降低[10]。因此，對(duì)PEG-PCL表面進(jìn)行靶向性修飾非常必要。RGD肽是一類(lèi)含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列且廣泛存在于體內(nèi)的短肽，它可以與腫瘤部位特異性表達(dá)的αvβ3、αvβ5等整合素特異性結(jié)合，從而達(dá)到主動(dòng)靶向腫瘤部位的目的[11]。

研究合成了具有主動(dòng)靶向性的納米載體c(RGDfC)-PEG-PCL，并優(yōu)化了c(RGDfC)-PEG-PCL的合成條件，探索了c(RGDfC)-PEG-PCL的最佳合成條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-1-叔丁酯(Fmoc-Asp-otbu)、N-芴甲氧羰?；?2,2,4,6,7-1五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸(Fmoc-Arg(pbf)-OH)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(trt)-OH)、N-芴甲氧羰基-D-苯丙氨酸(Fmoc-D-Phe-OH)、N-芴甲氧羰基-L-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)以及2-氯樹(shù)酯(負(fù)載量0.98 mmol·g-1，購(gòu)于合肥國(guó)肽生物科技有限公司)；N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、 (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸鹽(PyAOP)、N-乙基二異丙胺(DIEA)、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)以及三氟乙酸(TFA)、茚三酮等試劑均為分析純，甲醇、乙腈為色譜純(購(gòu)于阿拉丁試劑上海有限公司)；馬來(lái)酰亞氨基-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(Mal-PEG113- PCL55，購(gòu)于上海芃碩生物科技有限公司)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600M型核磁共振譜儀(以TMS為內(nèi)標(biāo)，2% D2O與98% H2O為溶劑，德國(guó)Bruker公司)；LC-20A 高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS C18液相色譜柱、ESI-MS-8030三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；DFY-5/25 低溫恒溫反應(yīng)浴儀(常州諾基儀器有限公司)；2XZ型旋片式真空泵(上海雙鵝制冷設(shè)備有限公司)、SHB-IV循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 c(RGDfC)-PEG-PCL的合成

(1)利用固相合成法合成直鏈肽RGDfC。在砂芯反應(yīng)器中合成得到含有直鏈五肽RGDfC的樹(shù)脂，用全保護(hù)切割法將多肽與樹(shù)酯分離，冷凍干燥后得到粗品直鏈肽RGDfC，粗品用半制備型高效液相色譜進(jìn)行純化，得到高純度的直鏈肽RGDfC。

(2)用液相環(huán)合法合成環(huán)肽c(RGDfC)。取純化后的直鏈肽RGDfC溶于無(wú)水二氯甲烷中，加入PyAOP、HOAT和DIEA作為縮合劑，0 ℃下過(guò)夜反應(yīng)；得到的環(huán)肽用TFA切割法除去氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基，得到粗品環(huán)肽c(RGDfC)；粗品環(huán)肽c(RGDfC)用高效液相色譜進(jìn)行純化得到高純度的環(huán)肽。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。稱(chēng)取50.0 mg靶向環(huán)肽c(RGDfC)和10.0 mg馬來(lái)酰亞氨基-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(Mal- PEG113-PCL55)于干凈的燒杯中，加入10 mL的DMF，并用玻璃棒攪拌直至固體完全溶解，調(diào)節(jié)pH值在7.5～8.0之間，加入DIEA作為催化劑，攪拌反應(yīng)24 h。

1.3 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的表征

(1)質(zhì)譜分析。利用ESI-MS對(duì)合成的靶向環(huán)肽進(jìn)行分析。取少量c(RGDfC)樣品，以甲醇為溶劑進(jìn)行稀釋溶解，甲醇為測(cè)試所用的流動(dòng)相，測(cè)試模式為正離子模式。

(2)核磁表征。利用核磁共振譜儀(以TMS為內(nèi)標(biāo)，2% D2O與98% H2O為溶劑)對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL進(jìn)行核磁表征，并對(duì)特征峰進(jìn)行歸屬。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率分析。反應(yīng)過(guò)程中游離的靶向環(huán)肽含量會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而減少，所以可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)前后靶向環(huán)肽的量，從而計(jì)算出產(chǎn)物的合成率。采用高效液相色譜儀對(duì)反應(yīng)前后的溶液進(jìn)行分析，根據(jù)c(RGDfC)在高效液相色譜中的出峰面積來(lái)計(jì)算合成率，計(jì)算公式如下：

式中，S0為c(RGDfC)的初始峰面積；S為反應(yīng)后c(RGDfC)的峰面積。

1.4 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的合成優(yōu)化

靶向環(huán)肽c(RGDfC)與納米載體Mal-PEG-PCL合成的本質(zhì)是邁克爾加成反應(yīng)，根據(jù)其反應(yīng)特點(diǎn)，從反應(yīng)時(shí)間、pH值、溫度、催化劑以及溶劑這5個(gè)方面研究c(RGDfC)-PEG-PCL合成的最佳反應(yīng)條件。

(1)反應(yīng)時(shí)間對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h。

(2)pH值對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察pH值對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，pH值設(shè)定為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0。

(3)溫度對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h、pH值為7.5，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察溫度對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，溫度設(shè)定為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃。

(4)催化劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h、pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DMF作溶劑，考察加入催化劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，設(shè)定為無(wú)催化劑組和加入催化劑DIEA組。

(5)溶劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h、pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑，考察溶劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，溶劑設(shè)定為甲醇、二甲基亞砜、DMF和DCM。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

靶向環(huán)肽c(RGDfC)的質(zhì)譜圖(ESI-MS)如圖1所示。c(RGDfC)的理論分子量為578.25，質(zhì)譜中主要的電荷峰只有一個(gè)，其電荷為579.25(M+H)H+，與理論分子量一致，說(shuō)明合成的多肽確為目標(biāo)產(chǎn)物c(RGDfC)。

圖1 c(RGDfC)的ESI-MS譜圖

2.2 核磁表征

靶向納米載體c(RGDfC)-PEG-PCL的氫譜圖(1H-NMR)如圖2所示。對(duì)氫譜圖中的各個(gè)峰進(jìn)行歸屬，可以看出圖譜中出現(xiàn)了環(huán)肽的特征峰，即酰胺健上的氫和苯環(huán)上的氫，這是PEG-PCL載體上沒(méi)有的峰，證明靶向環(huán)肽和載體已經(jīng)成功地連接上了。

圖2 c(RGDfC)-PEG-PCL的1H-NMR譜圖

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

時(shí)間對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖3所示。由圖3可知，在0～12 h內(nèi)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率快速上升，在此階段反應(yīng)迅速，產(chǎn)物迅速積累；在12～24 h內(nèi)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率緩慢上升，在此階段反應(yīng)逐漸減慢，產(chǎn)物積累緩慢；在24～28 h內(nèi)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率幾乎不變，在此階段反應(yīng)停止，產(chǎn)物不再積累。這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)物的濃度降低，產(chǎn)物積累變慢。所以，選擇反應(yīng)時(shí)間為24 h，c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL的反應(yīng)結(jié)束。

2.4 pH值對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

pH值對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖4所示。由圖4可知，pH在7.5～8.0之間，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率達(dá)到最高；pH高于8.0時(shí)，隨著pH的增大，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低。這是由于堿性條件有利于加成反應(yīng)的進(jìn)行，但堿性過(guò)高會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物的生成，因此最佳pH在7.5～8.0之間。

圖3 時(shí)間對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響 圖4 pH值對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

2.5 溫度對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

溫度對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖5所示。由圖5可知，在溫度為25 ℃時(shí)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率達(dá)到最高；當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低，這是由于提高溫度會(huì)增強(qiáng)邁克爾加成反應(yīng)的逆反應(yīng)，不利于合成產(chǎn)物c(RGDfC)-PEG-PCL的積累，所以，選擇在25 ℃左右為最佳反應(yīng)溫度。

2.6 催化劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

催化劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖6所示。由圖6可知，在反應(yīng)中加入堿性催化劑DIEA可以提高c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率。由于堿性催化劑有利于反應(yīng)物去質(zhì)子形成陰離子，促進(jìn)邁克爾加成反應(yīng)的進(jìn)行[12]，所以加入DIEA能夠促進(jìn)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。

圖5 溫度對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響 圖6 催化劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

2.7 不同溶劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

不同溶劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖7所示。由圖7可知，用DMF作為溶劑時(shí)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最高，這是由于多肽c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL在DMF中能夠溶解完全，有利于反應(yīng)的進(jìn)行；用甲醇作溶劑時(shí)，由于有部分反應(yīng)物無(wú)法溶解，導(dǎo)致c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率降低；用DCM作溶劑時(shí)，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最低，這可能是由于在反應(yīng)過(guò)程中，DCM揮發(fā)導(dǎo)致反應(yīng)物出現(xiàn)沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致c(RGDfC)-PEG -PCL的合成率降低；二甲基亞砜作為反應(yīng)溶劑，c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率與DMF相差不大。因此，選用DMF作為反應(yīng)溶劑，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率最高。

圖7 不同溶劑對(duì)c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

3 結(jié)論

采用邁克爾加成法，在反應(yīng)時(shí)間為24 h、pH值在7.5～8.0、溫度為25 ℃、加入堿性催化劑DIEA、用DMF作為反應(yīng)溶劑的最佳反應(yīng)條件下，將靶向環(huán)肽c(RGDfC)連接到載體Mal-PEG -PCL上，制備出具有腫瘤主動(dòng)靶向性的納米載體——c(RGDfC)-PEG-PCL?？刂品磻?yīng)時(shí)間為24 h，保證了反應(yīng)完全的同時(shí)，提高了實(shí)驗(yàn)效率；調(diào)節(jié)pH在7.5～8.0，堿性環(huán)境下有利于邁克爾加成反應(yīng)的進(jìn)行；控制溫度為25 ℃，有利于減少逆反應(yīng)的發(fā)生，保持多肽的活性，提高合成率；加入堿性催化劑有利于巰基失去質(zhì)子，形成陰離子，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行；用DMF作溶劑，在保證原材料完全溶解的同時(shí)，有利于產(chǎn)物的回收。該靶向納米載體制備工藝簡(jiǎn)單、生物相容性?xún)?yōu)良、靶向效果顯著，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供了新的思路。