精子DNA碎片指數(shù)(DFI)與體外受精結(jié)局的多因素Logistic回歸分析 *

梁曉東，莫淦文，紀 鵬，沈炳連，廖勇彬

(江門市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)診療中心，廣東江門 529000)

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，體外受精(IVF)技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，為不孕不育患者找到了孕育生命的希望。在體外條件下使精子和卵子結(jié)合受精形成受精卵，是孕育胚胎成功的第一步，也是較為關(guān)鍵的一步。然而，有不少患者夫婦在常規(guī)IVF后，仍然沒有能夠使精子和卵子結(jié)合受精，其中所發(fā)生的病理機制至今依然不太明確，極大地困擾著患者和醫(yī)務(wù)人員。雖然單精子卵漿內(nèi)注射(ICSI)技術(shù)能一定程度上解決IVF失敗的問題，但是這項技術(shù)卻帶來子代安全性的風(fēng)險。因此探討IVF失敗原因及風(fēng)險因素，至今依然具有重要的現(xiàn)實意義。目前已知這些風(fēng)險因素除了卵子因素[1]以外，也存在精子因素，其中，精子DNA碎片與IVF受精率之間的關(guān)系受到學(xué)界的關(guān)注，然而研究結(jié)論卻大相徑庭，有學(xué)者認為造成這些研究結(jié)論不同的原因主要是納入研究對象時女方基礎(chǔ)條件特別是年齡因素和卵巢儲備能力對研究結(jié)果造成的影響[2]。的確患者自身或者在超促排卵過程中某些原因可能引起卵母細胞成熟度下降，卵子透明帶還沒有發(fā)育成熟，使精卵結(jié)合能力下降，可能也會對IVF結(jié)局產(chǎn)生影響，也是不容忽視的因素。而Logistic多因素分析模型可篩選出一些疾病的危險因素并且可說明變量間的相互影響，因此可考慮用其來分析影響IVF結(jié)局的各個因素，從而找到精子DNA碎片對IVF結(jié)局的實際作用或影響。本文將對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧分析2011～2018年在我中心進行體外受精(IVF)/補救性單精子卵漿內(nèi)注射(R-ICSI)周期治療的患者夫婦資料。納入標準：①受精方式包括常規(guī)IVF和R-ICSI；②女方年齡≤35歲；③采用標準長方案治療的周期。排除標準：①經(jīng)皮附睪/睪丸穿刺取精(PESA/TESA)周期；②女方卵巢儲備功能低下：參照ZHANG等[3]對卵巢儲備功能低下的定義標準：基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)<5，或者基礎(chǔ)卵泡刺激素>10 U/L，或者曾經(jīng)出現(xiàn)在前一個卵巢刺激周期獲卵數(shù)<5的卵巢低反應(yīng)史；③卵母細胞冷凍周期。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(SCSA)試劑盒購自深圳華康生物有限公司；密度梯度離心液PureCeptionTM(40/80)(REF ART-2040，ART-2080)，精子培養(yǎng)液Quinn’s HTF medium(REF ART-1020)，卵子沖洗液HTF-HEPES購自CooperSurgical公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)購自Vitrolife公司。

1.2.2 儀器：NovoCyte流式細胞儀購自艾森生物科技有限公司，ICSI顯微注射針購自澳大利亞TPC公司，顯微操作系統(tǒng)NT88-V3來自于日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 促排卵方案：在促排卵的前1個月經(jīng)周期的黃體中期開始用促性腺釋放激素激動劑(GnRH-a)進行降調(diào)。用GnRH-a后16～20天，達到降調(diào)標準后使用促性腺激素(Gn)啟動，同時B超監(jiān)測卵泡發(fā)育以及測量血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)水平。當(dāng)至少1個卵泡直徑達18 mm或至少3個卵泡直徑達17 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)。注射HCG后34～36 h取卵。

1.3.2 精液采集及處理：男方禁欲3～5天，取卵日用手淫法收集精液，參照WHO第五版標準操作規(guī)程進行精子濃度、活力及形態(tài)分析。使用上游法或密度梯度離心法分離優(yōu)選精子。

1.3.3 體外受精和胚胎培養(yǎng)：取卵術(shù)得到的卵丘復(fù)合物經(jīng)過沖洗和洗滌后，收集并置于受精滴中，觀察其形態(tài)以初步判斷卵子成熟度。向受精滴加入處理后的精子進行常規(guī)IVF，采用短時授精技術(shù)，即精子加入4 h后剝離顆粒細胞和冠細胞觀察受精情況。若受精率<25%，則采取R-ICSI方案。R-ICSI受精卵需要在R-ICSI后13～15 h觀察原核，以判斷R-ICSI卵子的受精情況。

1.3.4 SCSA檢測精子DNA碎片指數(shù)(DFI)：精液液化后用Tris-NaCl-EDTA(TNE)緩沖液進行稀釋，取0.05 ml稀釋后的懸液置于流式細胞儀進樣管中，加入0.1 ml酸處理液處理30 s，再加入0.3 ml吖啶橙染色液，調(diào)整精子流速。檢測5 000個精子的熒光，用軟件分析各種熒光精子的比例并且計算出精子DFI。

2 結(jié)果

2.1 患者夫婦一般資料及體外受精狀況分析 見表1。從表中可見，組間女方基本條件的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而IVF總受精率隨著DFI的升高呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，R-ICSI的周期數(shù)和卵子數(shù)占比則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，提示精子DNA損傷可能對體外受精有負面的影響。

2.2 多因素回歸模型分析 見表2。把相關(guān)風(fēng)險因素納入Logistic回歸模型進行分析，其中：以是否需要使用R-ICSI技術(shù)作為因變量，把因受精率低而使用了R-ICSI技術(shù)進行受精的周期設(shè)定為1，把只使用了IVF技術(shù)進行受精的周期設(shè)為0；選定的孕產(chǎn)史自變量中夫婦間有孕產(chǎn)史設(shè)定為1，無孕產(chǎn)史設(shè)定為0，其他變量則直接使用定量數(shù)值。結(jié)果顯示，精子DFI的OR值為1.013(P=0.005)，提示精子DFI越高，受精率降低的風(fēng)險逐漸升高。另外從模型分析結(jié)果得出，夫婦間孕產(chǎn)史、HCG注射日血清E2，LH水平、獲卵數(shù)、前向運動精子(PR)總數(shù)，精子形態(tài)正常率也是低受精率的風(fēng)險因素。

表1 女方患者的基礎(chǔ)條件和體外受精狀況

表2 低受精率相關(guān)風(fēng)險因素的Logistic回歸分析

3 討論

IVF技術(shù)問世以來給不孕不育患者重新帶來孕育新生命的希望，然而仍然存在不少患者夫婦在使用了常規(guī)體外受精技術(shù)后，仍然沒有能夠使精子和卵子受精，存在受精率低的情況。后來單精子卵漿內(nèi)注射技術(shù)(ICSI)出現(xiàn)，一定程度上可以解決常規(guī)IVF過程中不受精的問題，然而已經(jīng)有報道證實，使用ICSI技術(shù)雖然人工使精卵結(jié)合，其優(yōu)胚率、囊胚形成率等比IVF低，胚胎移植后流產(chǎn)率比IVF要高[4]。而且ICSI技術(shù)人工把精子注入卵子內(nèi)，這些胚胎操作存在著一定的風(fēng)險，對子代安全性未明。所以探討影響常規(guī)IVF結(jié)局的風(fēng)險因素，預(yù)測IVF結(jié)局的好壞，依然具有重要的現(xiàn)實意義。

先前已經(jīng)有相關(guān)的報道曾探討精子DNA碎片對IVF結(jié)局的影響，結(jié)論也大不相同，其中，對于女方年齡及其基礎(chǔ)條件的控制和研究對象的選擇是影響結(jié)論的關(guān)鍵因素[5]。所以，研究精子因素對IVF結(jié)局的影響應(yīng)該從卵巢儲備功能良好的女方患者中選擇。盡管如此，仍然存在著一些可能影響結(jié)論的不可控制的伴隨因素，比如卵母細胞成熟度[6-7]，卵巢反應(yīng)性等。本研究選取了女性年齡35歲以下，卵巢功能良好的女方患者夫婦作為研究對象，通過對各因素進行多因素分析，提示女方卵子成熟度相關(guān)的激素水平、孕產(chǎn)史、男方精液質(zhì)量對受精情況有著顯著的影響，在以上伴隨因素情況下，分析結(jié)果依然提示精子DNA碎片指數(shù)是IVF受精過程中的一個重要的負面影響因素。

通過以上分析，我們發(fā)現(xiàn)精子DFI主要影響IVF過程，而對后面的R-ICSI受精影響不大，說明某些患者可通過R-ICSI獲得受精，提示了精子DNA完整率可能主要影響自然的精卵結(jié)合過程。過去，IVF受精率低，人們通常從頂體酶、頂體反應(yīng)等方面尋找原因。最近的研究也表明，精子DFI也能影響精子和卵母細胞的結(jié)合[8-11]。然而，精子的DNA損傷發(fā)生在精子的核，而精子與卵母細胞的識別只發(fā)生在兩者的表面，精子與卵母細胞發(fā)生接觸時，是精子膜而不是精子核與卵母細胞膜發(fā)生黏附識別。這暗示了精子的DNA損傷可能影響了與卵母細胞的識別過程，目前研究發(fā)現(xiàn)這個過程可能與精子表面的熱休克蛋白-70(HSPA2)有關(guān)[12]。在熱應(yīng)激或精索靜脈曲張等不利條件時HSPA2表達上調(diào)，可能起保護精子免受外界因素損傷或啟動DNA自我修復(fù)的作用。AGARWAL等[13]發(fā)現(xiàn)，高DFI精子往往伴有HSPA2減少，暗示在精索靜脈曲張時精子DNA的損傷可能與HSPA2表達不足有關(guān)。而HSPA2能促進精子與卵子透明帶的結(jié)合，與IVF受精率存在著正相關(guān)的關(guān)系[14]，這可能是精子高DFI影響體外受精過程的其中一種解釋。精子具有一定的自我修復(fù)能力[15]，至于為何HSPA2表達不足比較容易產(chǎn)生DNA損傷，以及HSPA2在啟動DNA修復(fù)中的生理作用，目前還沒有直接詳細的報道，因此還需要做進一步深入研究探討。

綜上所述，本文利用多因素模型分析研究精子DNA完整性與體外受精結(jié)局的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了精子DNA碎片指數(shù)是IVF受精過程中的一個重要的影響因素。精子DNA完整性對于IVF受精情況可能有一定的預(yù)測價值，是否可作為選擇受精方法的預(yù)測指標及DNA損傷的影響機制，仍需要深入的、多中心的進一步研究。