卵巢漿液性腺癌組織鋅指蛋白變體(Ciz1-V蛋白)的表達與患者預(yù)后的相關(guān)性研究 *

凌 玲，桑學(xué)涵，尹 靜，謝凌云，成 穎，程文國

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院揚州市婦幼保健院，江蘇揚州 225000；2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室，江蘇揚州 225000；3.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州 225000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌。卵巢癌起病較為隱匿，且早期缺乏特異性癥狀，患者確診時大多已處于疾病的進展期，其中卵巢漿液性腺癌是病理組織學(xué)中最常見類型，約占卵巢惡性腫瘤總數(shù)的42.9%[1]，其發(fā)病率高、病死率高、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，嚴重危害女性生命健康。影響卵巢癌預(yù)后的因素較多，根據(jù)患者情況綜合判斷預(yù)后是臨床醫(yī)生迫切需要解決的問題。

本課題研究的是一種新的蛋白突變體，即鋅指蛋白與周期蛋白依賴性激酶相互作用蛋白1(cyclin-dependent kinase interacting protein 1，Cip1)結(jié)合形成的Cip1相互作用的鋅指蛋白(Cip1 interacting zinc finger protein 1，Ciz1)的一種穩(wěn)定突變體，名為Ciz1-V蛋白，前期我們已分析過Ciz1-V蛋白在卵巢漿液性腺癌中的表達及臨床意義[2]，后期我們又繼續(xù)研究與卵巢漿液性腺癌預(yù)后相關(guān)的因素，本文選取了卵巢漿液性腺癌不同的分級方法以及分期方法，分析Ciz1-V蛋白的表達情況與卵巢漿液性腺癌預(yù)后的相關(guān)性，目前國內(nèi)外少見該蛋白在卵巢漿液性腺癌方面的報告。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本文所選40例卵巢漿液性腺癌標(biāo)本來自于揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院揚州市婦幼保健院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院2005年～2014年的住院患者，患者的年齡范圍為27～59歲，平均年齡47.65±1.26歲，其中以中老年患者居多，患者常見癥狀為腰痛、腹痛、下肢及外陰部水腫、月經(jīng)過少或閉經(jīng)、性激素紊亂等。患者均有完整的病理資料，且術(shù)前均未進行放化療。我們通過查閱患者的病程記錄、手術(shù)記錄以及各項檢查報告，將所需信息整理歸檔，并根據(jù)患者的聯(lián)系方式，采用電話、信息、郵件等相結(jié)合的方法，對所研究的患者進行隨訪，咨詢并記錄患者的術(shù)后生存情況，本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準。

根據(jù)卵巢癌患者細胞核的異型性、核分裂指數(shù)及腫瘤抑制蛋白P53的表達情況，卵巢漿液性腺癌被分為低級別和高級別兩級[3]，40例卵巢漿液性腺癌標(biāo)本中，13例為低級別卵巢漿液性腺癌，27例為高級別卵巢漿液性腺癌。卵巢癌的準確分型對手術(shù)方法的選擇及術(shù)后的放化療極為重要，在本研究中，卵巢癌的分期主要采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)病理分期法，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ，Ⅱ期者15例，Ⅲ，Ⅳ期者25例。

所選的40例患者的隨訪終止日期為2015年4月15日，隨訪時間為4～121個月，中位隨訪時間30個月，其中8例患者發(fā)生死亡，死亡率為20.0%。生存期定義為患者手術(shù)日期至死亡或隨訪的截止時間間隔。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法：檢測Ciz1-V蛋白所用方法為免疫組織化學(xué)法，基本操作步驟如下：a.石蠟組織連續(xù)4 μm切片，置于恒溫箱內(nèi)；b.將切片放入二甲苯、無水乙醇中脫水脫蠟后在組織上滴加3 ml/dl過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗后滴加1∶4 000 Ciz1-V蛋白抗體，置于濕盒中4℃冰箱過夜；c.第二天取出玻片，PBS沖洗后滴加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記，EnVision試劑盒)，室溫下孵育后再次用PBS沖洗；d.滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色，放置于自來水中終止反應(yīng)；放入蘇木素中襯染，自來水沖洗后置于返藍液中并再次用大量自來水沖洗；e.最終將玻片置于無水乙醇、二甲苯，中性樹膠封片。

1.2.2 結(jié)果判定方法：Ciz1-V蛋白主要定位于胞漿中(見圖1)。所有病理切片均由兩位資深病理醫(yī)生進行雙盲診斷。本實驗采用雙評分法判定Ciz1-V蛋白的表達強度，即綜合染色強度和著色細胞百分比。選取高倍鏡下10個視野分別計數(shù)100個細胞：①記錄細胞染色強度：未著色為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；深棕黃色為3分；②計算陽性細胞百分比：0%計0分；10%～50%計2分；51%～80%計3分；大于80%計4分。染色反應(yīng)強度評分和著色細胞的百分比評分，二者相加為綜合評分，最終結(jié)果表示方法：0分為(-)、(1～2)分為(+)、(3～4)分為(++)、大于5分為(+++)。本研究中我們將Ciz1-V蛋白的表達分為兩個等級，(-)和(+)為低表達級別，(++)和(+++)為高表達級別。

EnVision×400

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，篩選預(yù)后相關(guān)因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

FIGO分期為Ⅰ，Ⅱ期者生存率總體趨勢高于FIGO分期為Ⅲ，Ⅳ期者，但Kaplan-Meier生存曲線顯示本實驗中FIGO分期與生存期之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)，見圖2。

圖2 卵巢漿液性腺癌FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期患者與Ⅲ+Ⅳ期患者的生存曲線比較

從Kaplan-Meier生存曲線可以看出低級別卵巢漿液性腺癌患者總生存率高于高級別卵巢漿液性腺癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)，見圖3。在40例卵巢漿液性腺癌患者中Ciz1-V蛋白低表達組預(yù)后明顯較Ciz1-V蛋白高表達組預(yù)后差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)，見圖4。

圖3 高級別卵巢漿液性腺癌與低級別卵巢漿液性腺癌患者生存曲線比較

圖4 漿液性腺癌Ciz1-V蛋白高表達患者與低表達患者的生存曲線比較

3 討論

卵巢癌早期難以發(fā)現(xiàn)，70%的患者就診時已為晚期[4]。了解卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機制對卵巢癌的防治至關(guān)重要，但目前與其相關(guān)的機制尚未闡明[5]。已知的卵巢漿液性腺癌發(fā)病通路存在以下兩種：一種發(fā)展較慢，由良性腫瘤發(fā)展至交界性腫瘤，最終衍變?yōu)閻盒阅[瘤，這種通路是一個循序漸進的過程，存在野生型P53基因；另一種發(fā)展較快，由卵巢正常輸卵管上皮或囊腫直接發(fā)展而來，伴P53基因的突變。近年來隨著手術(shù)和化療的進步，卵巢癌患者的生存時間有所提高，其生存率的提高取決于理想的腫瘤細胞減滅術(shù)，一般情況下患者首先做腫瘤細胞減滅術(shù)，隨后無論腫瘤是否被切除干凈均需要進行化療或放療，初次手術(shù)是否徹底對患者的預(yù)后具有重要的影響。但卵巢癌患者總體預(yù)后仍然較差，其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制仍不清楚。因此，早期診斷是改善卵巢癌預(yù)后的關(guān)鍵，及時并準確的手術(shù)以及術(shù)后規(guī)范的化療是提高患者生存率的保證。

腫瘤的準確分期對臨床治療方案的選擇具有指導(dǎo)意義，有助于卵巢癌患者的早期診斷和個體化治療。在本研究中FIGO分期與生存期之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與本實驗中病例的選擇、腫瘤的異質(zhì)性以及免疫組化結(jié)果評定方法等因素相關(guān)。腫瘤的高低分級法跟傳統(tǒng)分級法相比更為簡單，且重復(fù)性較好，臨床應(yīng)用的可行性較高。卵巢漿液性腺癌的腫瘤分級已成為臨床上公認的預(yù)后影響因素之一，本研究中的結(jié)果與該結(jié)論相符，低級別卵巢漿液性腺癌患者總生存率高于高級別卵巢漿液性腺癌患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，腫瘤的分級越高，其生物學(xué)行為愈差，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率也就隨之增加，導(dǎo)致患者的預(yù)后越差，生存率越低。

生物學(xué)分子在影響卵巢癌細胞增殖或者分化的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[6]。除了分期、分級等傳統(tǒng)的預(yù)后因素外，我們需探索一些對其預(yù)后有特異性的腫瘤標(biāo)志物，為患者預(yù)后做出更加準確的判斷。鋅指蛋白是在非洲爪蟾卵母細胞的轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA中發(fā)現(xiàn)的一種生物活性物質(zhì)[7]，在調(diào)節(jié)基因表達、胚胎發(fā)育以及細胞分化等多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮著重要作用，它與Cip1蛋白結(jié)合形成Ciz1蛋白。有文獻報道，Ciz1蛋白與結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝細胞癌、膀胱癌等[8-11]腫瘤相關(guān)，每一種疾病中可能都存在一個特異性的癌變因素導(dǎo)致Ciz1蛋白或其轉(zhuǎn)錄物增加。Ciz1-V蛋白是Ciz1蛋白的一種穩(wěn)定突變體，有研究發(fā)現(xiàn)[12]，Ciz1-V蛋白位于肺部腫瘤的34/35區(qū)域，但未表達于肺部腫瘤旁組織，在早期肺癌患者血液中可檢測到Ciz1-V蛋白。

本研究中，Kaplan-Meier生存曲線顯示Ciz1-V蛋白低表達的卵巢漿液性腺癌患者術(shù)后各時點生存率均低于Ciz1-V蛋白高表達的患者，提示Ciz1-V蛋白表達水平的高低可預(yù)測卵巢癌患者的預(yù)后，有助于正確評估患者的狀況，篩選出預(yù)后不良的病例，該結(jié)果進一步提示Ciz1-V蛋白可能發(fā)揮抑癌基因作用，待進一步深入探究后有可能作為卵巢漿液性腺癌的預(yù)后的新指標(biāo)，為臨床制定個體化的治療方案提供依據(jù)。

綜上所述，Ciz1及其突變體在各種病理過程中都可能存在生物學(xué)效應(yīng)，其表達易受到腫瘤細胞影響，檢測卵巢疾病中Ciz1-V蛋白的表達水平可能是區(qū)分不同病理分期和病理分級的分子標(biāo)志物，對臨床治療及預(yù)后評估具有重要意義。在未來的醫(yī)學(xué)中，如何更好地通過Ciz1-V蛋白開展卵巢癌的早期診斷、預(yù)后分析以及如何通過靶向鋅指蛋白來干預(yù)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展均是我們研究的重難點。本研究回顧性分析患者臨床資料，存在的不足之處是所研究對象的樣本量較小，只能在較小的范圍內(nèi)進行數(shù)據(jù)分析，以后的研究中我們會增加樣本量，采用多種方法學(xué)，進一步探索卵巢漿液性腺癌的預(yù)后相關(guān)因素。